APC、β?catenin和c?myc在大肠癌中的表达及其意义

                  作者：戴文斌，任占平，陈蔚麟，杜娟，石喆，唐德艳

【摘要】  目的 探讨APC、β?catenin和c?myc在大肠癌发生、中的作用。方法 采用免疫组化方法检测30例正常大肠黏膜、30例大肠腺瘤、10例大肠腺瘤恶变及50例大肠癌组织中APC、β?catenin和c?myc蛋白的表达情况。结果 大肠癌和大肠腺瘤恶变APC阳性率分别为44.0%、40.0%，显著低于大肠腺瘤（86.7%）和正常大肠黏膜（100%）（P<0.01）。大肠癌、大肠腺瘤恶变和大肠腺瘤β?catenin胞浆和(或)胞核异位表达率分别为62.0%、50.0%、30.0%，显著高于正常大肠黏膜（0）（P<0.01），大肠癌β?catenin异位表达率显著高于大肠腺瘤（P<0.01）。大肠癌、大肠腺瘤恶变、大肠腺瘤c?myc阳性率分别为56.0%、60.0%、46.7%，显著高于正常大肠黏膜（0）（P<0.01）。大肠癌中β?catenin膜表达缺失率为：46.0%，显著高于大肠腺瘤（10.0%）和正常大肠黏膜(0)（P<0.01），且与大肠癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期有关。APC蛋白表达与大肠癌组织分化程度有关。大肠癌中β?catenin异位表达与c?myc阳性表达呈正相关关系（r=0.63，P<0.01），而与APC阳性表达呈负相关关系（r=-0.39，Ρ<0.05）。结论 APC失表达和(或)β?catenin异位表达，激活癌基因c?myc过表达与大肠癌的发生、发展密切相关，可能是大肠癌发生的早期事件；β?catenin膜表达缺失与大肠癌的侵袭、转移有关。

【关键词】  大肠癌；APC；β?catenin；c?myc

    大肠癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多基因异常改变的复杂过程。近年来，分子生物学研究发现Wnt信号传导通路成员各癌基因、抑癌基因的异常，激活下游相关靶基因的转录及细胞黏附分子异常与大肠癌的发生、发展密切相关，其中β?catenin在Wnt信号传导通路和细胞黏附中发挥关键作用。β?catenin具有双重功能，它是Wnt信号传导通路中的重要成员，β?catenin介导的Wnt信号传导通路异常激活与大肠癌的发生关系密切，同时β?catenin参与的E?cadherin/β?catenin复合体结构和功能异常在大肠癌的侵袭、转移中起重要作用。本研究应用免疫组化技术检测APC、β?catenin及c?myc蛋白在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变和大肠癌中的表达及其关系，以探讨Wnt信号传导通路及细胞黏附分子异常在大肠癌发生、发展中的作用。

    1  资料与方法

    1.1  资料  随机抽取我院1998年1月～2002年12月大肠癌根治性切除经病理确诊的50例大肠腺癌及同期手术切除和结肠镜活检并经病理确诊的30例大肠腺瘤，10例大肠腺瘤恶变标本。其中取癌旁10cm以上正常大肠黏膜组织30例作正常对照。大肠癌标本中男27例，女23例；年龄19～81岁，中位年龄60.5岁。大肠癌组织学分型，乳头状腺癌1例，管状腺癌43例，黏液腺癌4例，印戒细胞癌2例，其中高分化腺癌11例，中分化腺癌22例，低分化腺癌17例。已浸润至浆膜层者37例，未及者13例；伴有淋巴结转移者13例，无淋巴结转移者37例。按Dukes分期，A期11例，B期26例，C期9例，D期4例。大肠腺瘤标本中，管状腺瘤19例，混合型腺瘤8例，绒毛状腺瘤3例，腺瘤伴轻、中、重度不典型增生各10例。

    1.2  主要试剂与免疫组化方法

    1.2.1  主要试剂  浓缩型兔抗人APC多克隆抗体C?20、鼠抗人β?catenin单克隆抗体SC?7963、鼠抗人c?myc单克隆抗体SC?40均购自美国Santa  Cruz公司，工作浓度分别为：1∶200、1∶100、1∶100。Envision试剂盒购自福州迈新公司。

    1.2.2  免疫组化  所有标本均做4μm连续切片，作HE和免疫组化染色。按Envision二步法进行免疫组化染色，3种抗体孵育前，切片均经微波抗原修复，具体方法参照说明书。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知大肠癌阳性组织作为阳性对照。

    1.3  结果判断  免疫组化染色阳性信号为细胞出现棕黄色细小颗粒。β?catenin染色结果判断标准按照Maruyama等[1]方法，分别从细胞膜、细胞浆、细胞核三方面判断β?catenin在细胞内的分布：细胞膜＞70%细胞阳性为正常表达，反之为表达缺失；细胞浆或细胞核＞10%细胞阳性为胞浆或胞核阳性表达，胞浆或胞核表达称为异位表达；细胞膜表达缺失、胞浆或胞核表达统称为表达异常。APC以细胞浆，而c?myc以细胞核＞10%细胞阳性为阳性表达，反之为阴性表达。

    1.4  统计学处理  运用SPSS10.0统计软件进行χ2检验和相关性检验。

    2  结果

    2.1  APC、β?catenin和c?myc蛋白在不同大肠组织中的表达   

    APC阳性表达定位于上皮细胞浆，见图1。β?catenin正常表达定位于上皮细胞膜，见图2。大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变和大肠癌组织β?catenin胞膜表达不同程度缺失，β?catenin呈胞浆和(或)胞核异位表达，见图3。c?myc阳性呈胞核表达。正常大肠黏膜组织、大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变、大肠癌组织中APC、β?catenin和c?myc的表达情况，见表1。表1  APC、β?catenin和c?myc蛋白在正常大肠注：*分别与大肠腺瘤恶变、大肠癌比较，P<0.01；**分别与大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变、大肠癌比较，P<0.01；&与大肠癌比较，P<0.01；#分别与大肠腺瘤、正常大肠黏膜比较，P<0.01；△分别与大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变、大肠癌比较，P<0.012.2 APC、β?catenin和c?myc蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系  见表2。表2  APC、β?catenin和c?myc蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系注：*与未及浆膜层组比较，P<0.05；**与低分化组比较，P<0.01；#与有淋巴结转移组比较，P<0.01；△与A+B期组比较，P<0.012.3 APC、β?catenin和c?myc蛋白在大肠癌中表达的相关性  见表3。表3  APC、β?catenin和c?myc蛋白 在大肠癌中表达的相关性注：*β?catenin异位表达与c?myc阳性表达呈正相关，r=0.63；△β?catenin异位表达与APC阳性表达呈负相关，r=-0.39

　　 3  讨论

    Wnt信号传导通路是调控细胞生长、发育和分化的重要通路，其异常激活与肿瘤的发生密切相关[2]，而E?cadherin/β?catenin复合体是介导同型细胞间黏附的连接复合体，其在维持正常上皮的极性和完整性中起重要作用，肿瘤细胞间黏附的丧失是肿瘤侵袭、转移的关键。β?catenin是一个多功能蛋白，它在介导Wnt信号传导通路和细胞黏附中起中心分子作用，对肿瘤形成、分化、侵袭及转移中起重要作用。正常成熟细胞中没有Wnt信号，胞浆内的β?catenin大部分与胞膜上的E?cadherin结合，参与同型细胞间黏附，少部分与胞浆的APC、Axin、Gsk?3β结合形成降解复合物，最终被降解，因而胞浆的β?catenin水平降低，不能进入细胞核。而肿瘤细胞中存在异常的Wnt信号传导通路，APC或β?catenin基因突变或蛋白结构、功能异常导致β?catenin在胞浆内聚集，并进入细胞核内与Tcf/Lef结合激活相关靶基因如c?myc、cyclinD1等的转录，导致细胞癌变。

    APC是Wnt信号传导通路的重要组成分子，在Wnt信号传导通路中起负向调节作用，抑制其异常激活。同时，APC作为一种抑癌基因，是大肠黏膜上皮细胞增殖中的“看门”基因，它的突变或蛋白异常与大多数散发性大肠肿瘤发生有关。王东旭等[3]应用免疫组化技术证实在大肠腺癌及大肠腺瘤恶变中APC蛋白表达显著低于正常大肠粘膜，提出APC蛋白失表达可能与大肠癌的发生密切相关。本研究发现，APC蛋白定位于胞浆，正常大肠黏膜均呈阳性表达，而在大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变及大肠癌组织中其阳性表达率依次下降，在大肠腺瘤恶变时下降尤为明显，提示APC蛋白表达缺失可能与大肠腺瘤的恶变密切相关，且发生于大肠癌的早期阶段。APC蛋白失表达除与大肠癌的分化程度有一定关系以外，与大肠癌其他临床病理参数无关。作为Wnt信号传导通路中的正向调节分子，β?catenin在正常大肠黏膜中呈胞膜表达，无胞浆和(或)胞核表达，而在大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变和大肠癌中均不同程度存在异位表达和膜表达缺失，且呈逐渐升高的趋势，大肠癌异位表达率（62.0%）显著高于大肠腺瘤（30.0%）。大肠腺瘤恶变β?catenin异位表达率（50.0%）亦高于大肠腺瘤（30.0%），但差异无统计学意义，可能与大肠腺瘤恶变组例数较少（10例）有一定关系。在大肠癌发生、的过程中，腺瘤恶变是腺瘤由良性向恶性转化的最早期阶段，我们发现β?catenin异位表达率在腺瘤恶变组织中显著增高，提示β?catenin的胞浆聚集并进入核内，导致β?catenin的肿瘤性活化并激活下游靶基因可能在腺瘤恶变过程中发挥关键作用，同时显示腺瘤伴中、重度不典型增生β?catenin异位表达率（40.0%）显著增高，提示β?catenin异位表达在癌变前的腺瘤中、晚阶段就已发生，可能是大肠癌发生的早期事件。c?myc是Wnt信号传导通路下游的一个靶基因[4]。本组试验结果显示，大肠腺瘤，腺瘤恶变、大肠癌中均有c?myc过表达，以腺瘤恶变阳性率最高，而正常大肠黏膜未见阳性表达，表明c?myc过表达在大肠癌的发生过程中是一种频发事件。此外，通过对大肠癌中APC、β?catenin、c?myc表达的相关性分析发现，β?catenin异位表达与APC阳性表达呈负相关关系，而与c?myc过表达呈正相关关系，提示APC蛋白表达的缺失或降低可能导致β?catenin免于降解，游离的β?catenin在胞浆内聚集并进入核内，β?catenin异位表达可能是癌基因c?myc激活的重要原因。

    细胞间黏附能力的降低是肿瘤细胞发生侵袭、转移的前提条件，介导上皮细胞黏附最主要的成分是E?cadherin/β?catenin复合体，其结构和功能异常可引起肿瘤侵袭、转移。Ikeguchi等[5]研究发现E?cadherin/β?catenin复合体的表达异常与大肠癌的侵袭与转移密切相关。我们在分析大肠癌临床病理参数与β?catenin胞膜表达缺失的关系中发现，大肠癌高、中分化组中β?catenin胞膜表达缺失率显著低于低分化组，而浸润至浆膜层组中β?catenin胞膜表达缺失率显著高于未及浆膜层组，因此我们认为β?catenin胞膜表达缺失与大肠癌的恶性行为和去分化有一定的相关性，是大肠癌获得高增殖活性和侵袭性的原因之一。同时发现伴淋巴结转移组和DukesC、D期大肠癌β?catenin胞膜表达缺失率显著高于无淋巴结转移组和DukesA、B期。β?catenin异位表达与肿瘤侵袭、转移及预后的关系尚有不同意见。李刚等[6] 研究发现β?catenin异位表达、膜表达缺失与大肠癌侵袭、转移密切相关，而段光杰等[7]认为β?catenin胞核异常表达与大肠癌淋巴结转移及Dukes分期有关。本研究结果未发现β?catenin异位表达与大肠癌分化、侵袭、转移及Dukes分期有关。因此，APC失表达和(或)β?catenin异位表达介导的Wnt信号传导通路异常激活导致大肠癌发生是早期事件，而β?catenin胞膜表达缺失是肿瘤获得高侵袭、转移潜能的重要原因之一，是大肠癌发生、发展过程中的晚期事件，也是判断大肠癌生物学行为的分子标记物，在预测大肠癌转移潜能，评价预后，指导临床处理有重要意义。

【】
  ［1］ Maruyama K,Ochiai A,Akimoto S,et al.Cytoplasmic beta?catenin accumulation as a predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancer[J].Oncology,2000,59(4): 302?309.

[2] Michaelson JS,Leder P.Beta?catenin is a downstream effector of wnt?mediated tumorigenesis in the mammary gland[J].Oncogene,2001,20(37): 5093?5099.

[3] 王东旭,苏玲,闫晓初,等.APC蛋白在大肠粘膜、腺瘤及大肠腺癌中的表达[J].华北国防医药,2002,14(4): 235?236.

[4] Giles RH,van Es JH,Clevers H.Caught up in a Wnt storm:Wnt signaling in cancer [J].Biochim Biophys Acta,2003,1653(1):1?24.

[5] Ikeguchi M,Makino M,Kaibara N,et al.Clinical significance of E?cadherin?catenin complex expression in metastatic foci of colorectal carcinoma[J].J Surg Oncol,2001,77(3): 201?207.

[6] 李刚,王万里,魏莉.E?cadherin、β?catenin、FAK在大肠癌的表达及其意义[J].肿瘤防治研究,2005,32(9): 542?544.

[7] 段光杰,阎晓初,卞修武,等.β?链接素和基质金属蛋白酶?7在结直肠腺瘤?腺癌组织表达的意义[J].中华病杂志,2004,33(6): 518?522.