DNA修复复合体DNA?PK——肿瘤放疗中的药理学靶点
【关键词】 DNA修复; DNA?PK抑制剂; 肿瘤; 放疗增敏
目前在研究有关肿瘤细胞对放疗敏感性方面,DNA修复蛋白的抑制剂是一个热点。在修复DNA的蛋白中,DNA依赖的蛋白激酶(DNA?PK)参与了多细胞生物的非同源末端连接(NHEJ)过程,能保护由于电离辐射所致双链DNA被破坏的细胞,所以它的特异性抑制剂作为放疗增敏剂倍受关注。本文就DNA损伤修复的机制及DNA?PK抑制物的生物学特性进行阐述。
1 概述
为提高肿瘤患者的生存率,应不断选择毒副作用尽量小的综合方法。寻找能有效抑制DNA损伤修复的因子以运用到放疗增敏中,是目前研究的一热点。DNA损伤触发各种细胞应答,其中包括DNA的自我修复,途径有逆转,切除或再结合等,可以多种途径共同参与。研究表明,对放疗不敏感的肿瘤细胞,其DNA具有很强的修复活性。据此制药公司一直着手于对DNA修复抑制剂的开发。
但DNA修复抑制剂可引起不良反应。因DNA修复是正常细胞的生理现象,参与基因稳定性的维持,其活性被抑制可导致碱基错配修复或核苷剪切修复能力的下降,引发正常组织恶变,因此将DNA修复活性作为药靶点时必须仔细研究其修复机制及参与反应的关键蛋白,以助评估潜在副作用如细胞毒性或癌变,并设计特异性强的抑制剂。
在各种DNA修复途经中,具有两个临床应用价值:(1) 由O6?烷基鸟嘌呤甲基转移酶(AGT)所参与的O6?烷基鸟嘌呤的逆转机制[1];(2) 主要通过非同源末端连接(NHEJ)途经的双链损伤修复机制[2]。在哺乳动物细胞中NHEJ途径需要一些因子的参与,其中DNA依赖的蛋白激酶(DNA?PK)是参与双链损伤修复的修复复合体的基本组成成分。本文主要讨论DNA?PK作为一个药理学靶点的相关内容、其抑制剂的生物学特性以及增加细胞对放疗敏感性的影响。
2 NHEJ途径中的双链损伤修复复合体DNA?PK
当DNA双链受到损伤时,细胞将通过不同的途经启动应答克服损伤进行修复。尽管同源性重组修复可恢复DNA链的连续性,但哺乳动物细胞中NHEJ途径在双链损伤修复过程中起主要作用。NHEJ主要依赖6个核心因子包括:Ku70、Ku80、DNA?PKcs、XRCC4、连接酶IV和Artemis[3,4]。而DNA?PK这个丝/苏氨酸激酶,正是包括催化亚单位DNA?PKcs和调节亚单位Ku蛋白两部分的复合物,它通过激活后的构像改变[5],产生生物学效应。DNA?PKcs是由4127个氨基酸组成的相对分子质量约470000的大分子量蛋白质,其基因位于8q11。其C?末端结构域和参与信号传导的磷脂酰肌醇激酶3(PI3?K)有同源性,故属PIKK(PI3?K样激酶)家族,其靠近激酶活性区的 3002?3850位氨基酸处是与ku蛋白相互作用的部位,细胞凋亡时DNA?PKcs在肽链中间部位断裂而失活;Ku蛋白是一种自身抗原,由2条多肽链紧密结合在一起形成异二聚体结构,两条肽链分别称Ku70和Ku80。人Ku70基因位于22q13,编码609个氨基酸,相对分子质量约69000;Ku80基因位于2q33?34,编码732个氨基酸,相对分子质量约83000。双链损伤(DSBs)修复时,2个Ku分子通过一个预先形成的通道特异性地连接到双链损伤处,分别识别并结合于每一条DNA链末端,然后以ATP依赖的方式沿DNA链分别向两端滑动一小段距离,同时Ku本身所具有的弱解旋酶活性使2个断端局部解链。从而形成Ku?DNA复合物吸引DNA?PKcs到损伤部位[4],与之结合并激活其丝/苏氨酸激酶活性,磷酸化参与修复及损伤信号传导的一系列蛋白质,如断端经核酸外切酶修剪、DNA聚合酶填充等,还需通过另一复合物即异二聚物XRCC4/连接酶IV的帮助[6],其参与DNA断裂再接的过程;而蛋白Artemis则在发夹末端受损时起一定作用。综上可见,核心因子DNA?PK联合其他因子共同参与了NHEJ过程。最终当DNA链一旦连接起来,DNA?PK即发生自身磷酸化,使2个亚单位从DNA链上解离。另有研究发现,DNA?PK在维持染色体末端端粒的稳定性及防止染色体端端融合等方面起作用。
3 DNA?PK的激酶活性
DNA?PKcs具较弱蛋白激酶活性[7],当DNA?PKcs经由Ku/DNA 复合物介导催化后,激酶活性大大增强。虽在其他序列中丝/苏氨酸结构也可发生磷酸化,但一般发生在S/T?Q结构。虽尚未发现DNA?PK对翻译后的修饰起作用,但它可将体外的Ku和细胞内的XRCC4磷酸化,体外试验也已证实Artemis一旦被磷酸化则将改变其核酶活性。DNA?PKcs在细胞经受放疗后会发生自身(包含40个氨基酸的区域和其他位点)磷酸化并被激活[8],与Ku解离,这样DNA双链损伤修复的后续加工处理和连接步骤才能继续进行[8]。有模型研究发现[9,10],DNA?PKcsC端自身磷酸化可使DNA末端发生自身磷酸化,使完成修复任务的DNA?PK从DNA末端分离下来。业已表明DNA?PKcs抑制剂可阻碍DNA?PK结合在DNA的末端,阻止DNA末端的处理。自身磷酸化是细胞内双链损伤修复过程的关键。在细胞内,DNA?PK抑制剂在双链损伤修复过程中不单阻止NHEJ,也阻碍同源重组,这更体现抑制剂作为放疗增敏剂所具有的潜在作用[11]。
4 DNA?PK 是药理学靶点
基于DNA?PK的表达或活性的增减与肿瘤细胞对放疗敏感性之间的关系密切,DNA?PK作为一个药理学新靶点,DNA修复抑制剂得到广泛研究。细胞突变时,DNA?PK表达缺乏导致对放射性药物或电离放射的敏感性增加[2]。类似地,反义或siRNA转染后DNA?PKcs或Ku表达的下降也可导致对双链损伤诱导剂的敏感性增加[12]。Dongmei Lu等[13]利用siRNA的方法敲除DNA?PK的基因,可以抑制TNF介导的Akt及PKCε的磷酸化,加速细胞凋亡,表明PKCε活化Akt需通过DNA?PK抗凋亡,且DNA?PK可以从Akt开始调节受体激酶凋亡。来源于迟发性放射坏死病人的两个细胞系对双链损伤修复能力的下降与DNA?PK活性的下降呈正比[14]。Tonotsuka等[15]检测食管癌Ku70、Ku80 以及DNA?PKcs的表达,发现这些蛋白的表达较对照组癌旁正常组织都明显增高,而肿瘤内各部分DNA-PK表达的不均一,与肿瘤的进展与分化水平有关。另外,DNA?PK下调可使细胞对低剂量的放疗具有敏感性,这体现了它在细胞对低剂量放射(下降0.5Gy)进行应答的重要作用,使得DNA?PK成为一个很具吸引力的靶分子。
5 DNA?PK的抑制剂
目前发现,可通过降低蛋白的表达,抑制修复复合体的聚合及拮抗激酶活性等方法抑制DNA?PK活性。已设计出对抗Ku或者DNA?PKcs的反义寡核苷酸,它可使蛋白表达降低。DNA?PK结合到DNA末端这个过程怎样被抑制的呢?Ku是一种含量丰富的核蛋白,具有与DNA末端结合的主要活性,但因结构的原因缺乏与DNA末端结合的特异性位点,因此抑制Ku与DNA末端的结合并非理想靶点;相反DNA?PKcs与Ku的聚合是通过与Ku80的C末端(720?932个氨基酸)之间的相互作用而完成,如将外周淋巴细胞中的Ku80切除一端(C末端),剩余部分与Ku70形成一有功能的异二聚体,它能与DNA结合但不能激活DNA?PK的酶活性,这种能阻止DNA?PKcs与Ku结合的目标肽,是一种以肽为基础的DNA?PK抑制剂,可抑制双链损伤修复活性,增加细胞对放疗敏感性[16]。
研究主要目标是确定能抑制DNA?PK激酶活性的小分子。因DNA?PK与PI3?K具同源性,故可推测PI3?K抑制物的衍生物可抑制DNA?PK及双链损伤信号激酶。DNA?PK抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)是ATP非竞争性抑制剂,能与DNA?PKcs及其他PIKK家族成员激酶的ATP结合位点共价结合。PI3?K在细胞质中的IC50是2~3nm,而DNA?PK的IC50超过其100倍。体内有效渥曼青霉素浓度过高,且渥曼青霉素水溶性差,在水溶性溶剂中的稳定性也差,限制了其临床应用性。
一种更有效的人工合成槲皮素衍生物,2?(4?吗啉基)?8?苯基?4H?苯并吡喃?4?one( LY294002),作为DNA?PK上ATP的竞争者在抑制DNA?PK的同时也抑制PI3?K,但在达到DNA?PK的抑制浓度的同时,也抑制了参与多信号途经的激酶CKII。
有报道称DNA?PK特异性抑制剂香兰素可加强某些DNA损伤剂的细胞毒性,也能抑制X线诱导的染色体畸变,但其在体内的IC50高达毫米浓度水平,同样不适用于临床[17]。
最近BP Nutley等[18]对DNA?PK抑制物NU7026进行临床前药动学及代谢情况进行研究,发现每秒10μM是NU7026的最低给药速度,在人卵巢癌细胞暴露3Gy电离强度后4小时起放射增敏作用,以5mg/kg的量经静脉注入大鼠体内,因清除率很高以0.1108/H的速度从血浆清除,以20mg/kg的量静脉与口服的生物利用度分别为20%、15%。他们认为NU7026应每天分4次以总量100mg/kg经静脉给药才能达到放疗增敏效果。
渥曼青霉素和LY294002等是DNA?PK和PI3?K的非特异性抑制剂,而PI3?K抑制剂可诱导细胞周期的停止,以及导致全身毒性包括生长因子信号参与的许多细胞生理过程[19],因此开发对DNA?PK特异性高,而对其他PI3?K影响极小的抑制剂非常重要。
另外,有人发现含苄达明?2?ones复合物具有特异性激酶抑制作用,从此库筛选出的药物SU11752可通过竞争ATP结合位点抑制DNA?PK,其IC50为0.13μM[20],当浓度为12μM时,SU11752尚可抑制双链损伤的修复;浓度为50μM时,可使放疗的敏感性增强5倍。也发现当SU11752在IC50为1.1μM时,也可抑制p110γ,这表明放疗敏感性的增加可能由于抑制了其他因子而非DNA?PK。
6 结论
大多数放疗所产生的DNA损伤可被特异性或非特异性途径识别并修复,几乎所有的损伤都不是只通过一条途径修复的,且很多时候细胞仅通过一条途经就可生存下来。因此修复活性的抑制,尤其是作为DNA修复基本组分的DNA?PK活性的抑制在放疗增敏方面有重要作用。放射肿瘤学的核心是能靶向肿瘤细胞并使正常组织的损伤保持在一个可耐受的水平,对此,DNA?PK抑制剂的开发与应用是关键,但究竟哪一种肿瘤组织在利用DNA?PK抑制剂时特异性强呢?除带来全身毒性和染色体不稳定性的潜在后果外, DNA?PK的活性是否可以明确地作为肿瘤细胞对放疗敏感性的一个重要指标呢?这些都是我们需要进一步研究的课题。另外目前的研究已表明对于实体瘤,放疗联合DNA?PK抑制剂由于全身毒性小而成为具有应用前景的项目。然而,因为并不能顺利展开关于全身毒性的临床试验,DNA?PK抑制剂应用的浓度只能来自体外细胞试验的推断,因此仍有待于开发更多有潜力的抑制剂。
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