甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控

【摘要】  目的探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制。方法培养宫颈癌细胞C?33A、HeLa、CasKi、SiHa 及人脐静脉血管内皮细胞ECV?304，进行5?aza?dC干预前后FHIT基因在5株细胞中的甲基化分析，并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测5?aza?dC干预前后FHIT基因在5株细胞中的表达。结果4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化，正常对照细胞ECV?304在5?aza?dC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物。4株宫颈癌细胞在5?aza?dC化学干预前均未见明显FHIT的荧光着色，而干预后的细胞胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在10?6M及2×10?6M干预浓度下的表达最强(P<0.05)；干预48 h、72 h后FHIT 的表达与干预24 h的类似。ECV?304细胞在5?aza?dC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异(P>0.05)。结论FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，甲基化可能是FHIT 基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。

【关键词】  脆性组氨酸三联体基因（FHIT）；人宫颈癌细胞系；5?aza?dC；DNA甲基化；免疫荧光

　　Pattern of FHIT Gene 5’ CpG Island Methylation Contribute to Human Cervical Carcinoma Cell Tumorigenesis

　　Abstract：Objective To determine whether hypermethylation of FHIT played an important role in cervical tumorigenesis.MethodsBy incubating DNA in the presence of a methylase, we investigated the methylation of FHIT in four cervical cancer cell lines and one human umbilical vein endothelial cell line treating with the DNA methyltransferase inhibitor, 5?aza?2'?deoxycytidine(5?aza?dC). The expression of FHIT was also monitored by RT?PCR and immunofluorescence technique before and after 5?aza?dC treatment.ResultsWe found that methylation of FHIT occured in the four cervical cancer cell lines instead of the ECV?304. Through RT?PCR and immunofluorescence technique, we found that the expression of FHIT, which could hardly be detected in all four cervical cancer cells, was significant different after 5?aza?dC treatment. However, the ECV?304 cell expressed FHIT at constant levels before and after 5?aza?dC treatment.ConclusionWe concluded that hypermethylation of FHIT gene occurred frequently in cervical tumorigenesis. And hypermethylation within the regulatory sequences of FHIT gene might be an important means for its inactivation in cervical cancer. 

　　Key words：Fragile Histidine Triad Gene (FHIT); Human cervical cancer cell lines; 5?aza?2'?deoxycytidine; DNA methylation; Immunofluorescence technique

　　0引言

　　脆性组氨酸三联体( FHIT)基因是近年发现的第1个将染色体脆性位点和肿瘤相联系的候选抑癌基因，FHIT蛋白表达下调的肿瘤细胞更具有恶性表型和恶性行为，因而它很可能是一种在多种肿瘤发生中起重要作用的肿瘤抑制基因，但它通过何种机制发生作用尚不清楚。研究发现DNA5’CpG岛甲基化在基因表达、肿瘤发生过程中起重要作用[1]，但目前国内外对于甲基化引起FHIT基因失活及其与肿瘤发生的关系在宫颈癌方面的研究还很少，所以本文通过研究在DNA甲基转移酶抑制剂5?氮脱氧胞苷(5?aza?2’?deoxycytidine, 5?aza?dC)的化学干预下FHIT基因在宫颈癌中的表达及其甲基化调控，以探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制，以期进一步探讨宫颈癌的发病机制。

　　1材料与方法

　　1.1细胞系与培养4株宫颈癌细胞C?33A、HeLa、CasKi、SiHa 及一株正常对照细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV?304均购自ATCC（American type culture collection）。CasKi用含10%胎牛血清的RPMI? 1640培养液，37℃，5％CO2培养，其余细胞均用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。

　　1.25?aza?dC化学干预5?aza?dC购自Sigma公司，干预时用培养基稀释为0M，5×１0-7M，10-6M，2×10-6M，5× 10-6M，10-5M的工作浓度。接种对数生长期的细胞2× 10-5/60mm培养皿，培养24小时后以上述工作浓度的5?aza?dC进行化学干预。再培养24h和72h后，收集细胞。

　　1.3基因组DNA的提取参照姜泊[2]所著《分子生物学常用实验方法》提取高分子量细胞基因组DNA，在紫外分光光度计上测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间为合格。

　　1.4甲基化分析采用甲基化酶温育法,用10U甲基化敏感酶HpaⅡ将1 μg基因组DNA 37℃酶切过夜，以使其完全消化；同时用10U非甲基化敏感酶MspⅠ完全消化基因组DNA为对照。然后进行PCR扩增FHIT基因，引物序列及PCR反应条件参照[3]。若出现FHIT基因的扩增产物，则证实甲基化存在。

　　1.5逆转录聚合酶链式反应（RT?PCR）用TRIZOL试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪检测纯度和浓度，取2μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录，PCR扩增FHIT基因，并同时扩增GAPDH作内参照，引物由上海博亚生物公司合成；引物序列及PCR反应条件参照文献[4]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察、拍照。

　　1.6免疫荧光化学染色兔抗人FHIT多克隆一抗试剂购自北京中山生物技术公司。细胞培养24h，再用上述工作浓度的5?aza?dC进行化学干预，培养24h、48h和72h后，取出细胞爬片，PBS冲洗， 冷丙酮固定，1%Triton X?100室温作用20 min，血清封闭，再分别加入兔抗人FHIT多克隆抗体，4℃过夜后，分别加入羊抗兔FITC?IgG，37℃温育后封片。实验同时设PBS代替一抗的阴性对照。

　　1.7统计学方法运用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析，采用t检验。

　　2结果

　　2.1宫颈癌中FHIT基因甲基化分析HapⅡ和MspⅠ为同裂酶，两者都可以切开CCGG序列；而该序列甲基化为CmCGG时只有非甲基化敏感酶MspⅠ可切开，甲基化敏感酶HapⅡ的切割被阻断，由此差异可判断其甲基化情况。本实验结果显示4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化，因而未行去甲基化干预前以HapⅡ酶切及PCR扩增均可见不同程度的FHIT基因扩增产物，以5?aza?dC干预后再行HapⅡ酶切及PCR扩增则未见明显FHIT基因扩增产物，正常对照细胞ECV?304在5?aza?dC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物，差异有统计学意义（P<0.05）。

　　2.2RT?PCR检测5?aza?dC化学干预前后各株细胞中FHIT mRNA的表达用FHIT与GAPDH的IA比值表示FHIT基因的表达水平，比值越大，FHIT表达程度越高。CasKi细胞IAFHIT/IAGAPDH在不同浓度5?aza?dC干预24 h后的值分别为0.17±0.03(0M)，0.45±0.04(5×10-7M)，0.89±0.08(10-6M)，0.84±0.03(2× 10?6M)，0.75±0.09(5×10-6M)，0.64±0.03(10-5M),在10-6M及2× 10-6M干预浓度下表达最强。干预72 h后FHIT mRNA表达与干预24 h的类似，但相对吸光度的值略低于后者；显示5?aza?dC以10?6M及2×10-6M浓度干预24 h可诱导FHIT表达显著增强。其余３株宫颈癌细胞所得结果与此类似。而ECV?304细胞在干预前后均可见到较强FHIT mRNA表达，且相对吸光度的值无明显差异，提示5?aza?dC对宫颈癌细胞FHIT基因的甲基化调控与正常对照组细胞相比较差异有统计学意义（P<0.05），见图1、2。

　　M:100bp的DNA Marker1:5?aza?dC的浓度为0M2：5?aza?dC的浓度为5×10-7M3：5?aza?dC的浓度为10-6M4：5?aza?dC的浓度为2×10-6M5:5?aza?dC的浓度为5×10-6M6:5?aza?dC的浓度为10-5M

　　图1不同浓度的5?aza?dC作用于CasKi细胞24h和72h后的FHIT mRNA水平的变化（略）

　　M:100bp的DNA Marker1:5?aza?dC的浓度为0M2：5?aza?dC的浓度为5×10-7M3：5?aza?dC的浓度为10-6M4：5?aza?dC的浓度为2×10-6M5:5?aza?dC的浓度为5×10-6M6:5?aza?dC的浓度为10-5M

　　图2不同浓度的5?aza?dC作用于ECV?304细胞24h和72h后的FHIT mRNA水平的变化（略）

　　2.3免疫荧光检测5?aza?dC化学干预前后各株细胞中FHIT的表达5?aza?dC化学干预前4株宫颈癌细胞均未见明显FHIT的荧光着色，经过5?aza?dC化学干预后，4株细胞的胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在10-6M及2×10?6M干预浓度下的表达最强；干预48、72 h后FHIT 的表达与干预24 h的类似。ECV?304细胞在5?aza?dC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异，见图3~5。

　　3讨论

　　既往研究表明HPV感染是宫颈癌发生的主要病因，但随着研究的深入，人们发现单纯HPV感染并不一定引起癌症的发生，可能有协同因子的存在[5],故而目前宫颈癌相关基因的研究成为热点。FHIT基因定位于3p14.2，因其跨越了人类染色体脆性部位FRA3B(frequent breakpoint in 3p14.2 fragile site)编码的蛋白质和具有三价组氨酸结构域的HIT蛋白质家族高度同源而得名[6]。FHIT基因编码的蛋白质是1种典型的二核苷酸5’,5’?p1,p3?三磷酸盐（Ap3A）水解酶，而二核苷酸多磷酸盐是参与细胞分化和凋亡的细胞间、细胞内的信号分子；FHIT基因过表达可能诱导肿瘤细胞凋亡，改变细胞周期，停滞在S期细胞数量增多，肿瘤的生长被抑制[7，8]。而甲基化是人类基因组DNA最重要的表观遗传学修饰方式，可引起基因沉默，它的改变在肿瘤发生中起到重要的作用[9]。本实验研究发现，FHIT基因在4株宫颈癌细胞系中均存在甲基化形式（尤其在HPV阳性细胞系CasKi、HeLa、SiHa中），而在正常对照组细胞（ECV?304）中未见其甲基化形式，提示FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，且可能是宫颈癌发生的早期事件。我们以RT?PCR法检测到经5?aza?dC去甲基化后FHIT mRNA在4株宫颈癌细胞中表达明显增强，而正常对照细胞则无显著性变化。而在免疫荧光检测5?aza?dC化学干预前后各株细胞中FHIT的表达中，5?aza?dC化学干预前4株宫颈癌细胞均未见明显FHIT的荧光着色，经过5?aza?dC化学干预后，4株细胞的胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在10-6M及2×10-6M干预浓度下的表达最强(P<0.05)；干预48 h、72 h后FHIT 的表达与干预24 h的类似。ECV?304细胞在5?aza?dC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异(P>0.05)。应用去甲基化剂5?aza?dC处理，失活的FHIT基因可重新表达，结果提示应用合适剂量的甲基化抑制剂就可以通过特异性的干预肿瘤组织中的高甲基化抑癌基因FHIT，激活其表达，从而导致肿瘤细胞周期阻滞并凋亡。我们的研究表明FHIT基因的甲基化是FHIT基因表达下调的重要机制，该基因的异常可能导致了细胞生长与生长抑制信号的调控失衡，从而使细胞生长失控形成肿瘤，因而FHIT基因可能作为抑癌基因在宫颈癌的发生发展中起重要的作用；而通过人为抑制FHIT的甲基化，有可能抑制肿瘤的进展。以上结果都说明了甲基化可能是FHIT 基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。但FHIT基因是否是先于HPV感染就发生的分子生物学变化？FHIT基因是否能成为控制宫颈癌发展进程的靶点？随着高通量新技术如cDNA 微阵列、蛋白质二维电泳和其后的质谱分析以及蛋白芯片等方法的应用，这些问题必将会得到越来越深入的研究，并将逐步得到解答。

【】
  　 ［1］Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, et al. Aberrant CpG?island methylation has non?random and tumor?type?specific patterns [J]. Nat Genet, 2000, 24(2):132?138.

　　[2]姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].第1版.北京：人民军医出版社，1996.111?112.

　　[3]Asensio AC, Rodríguez?Ferrer CR, Oaknin S, et al. Biochemical and immunochemical characterisation of human diadenosine triphosphatase provides evidence for its identification with the tumour suppressor Fhit protein[J]. Biochimie, 2006, 88(5): 461?471.

　　[4]Tanaka H, Shimada Y, Harada H, et al. Methylation of the 5'CpG island of the FHIT gene is closely associated with transcriptional inactivation in esophageal squamous cell carcinomas [J].Cancer Res, 1998, 58(15): 3429?3434.

　　[5]Greenspan DL, Connolly DC, Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors[J]. Cancer Res, 1997, 57: 4692?4698.

　　[6]Knebel DM. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections [J] . Eur J Cancer, 2002, 38(17): 2229 ? 2242.

　　[7]Zochbauer MS, Fong KM, Maitra A, et al. 5'?CpG island methylation of the FHIT gene is correlated with loss of gene expression in lung and breast cancer[J]. Cancer Res, 2001, 61(9): 3581?3585.

　　[8]Garrison PN, Robinson AK, Pekarsky Y, et al. Phosphorylation of the human Fhit tumor suppressor on tyrosine 114 in Escherichia coli and unexpected steady state kinetics of the phosphorylated forms[J].2005, 44(16): 6286?6292.

　　[9]Knebel DM. New markers for cervical dysplasia to visualize the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections[J]. Eur J Cancer, 2002, 38(17): 2229?2242.