特异性沉默Eca109细胞系stathmin基因siRNA表达载体的构建
作者：王峰，王留兴，王瑞林，樊青霞，赵培荣
【摘要】 目的构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPER?S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法用DNA重组技术，将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER?EGFP，应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPER?S转染细胞系Eca109，G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，RT?PCR检测转染细胞stathmin mRNA的表达。结果重组逆转录病毒载体经EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切，可见4692 nt和285 nt条带；测序结果表明插入序列正确；重组载体转染Eca109细胞，可表达绿色荧光蛋白（EGFP），经G418筛选得到抗性细胞克隆，转染细胞stathmin mRNA的表达较对照组明显减弱。结论特异性沉默stathmin基因的pSUPER?S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。
【关键词】 小干扰RNA；stathmin基因；pSUPER?EGFP载体；Eca109细胞
Abstract：Objective To construct and identify a recombinant retroviral vector pSUPER?S that target stathmin gene and a stable virus?producing cell line.MethodsThe 64nt encoded targeting stathmin gene shRNA sequence was cloned into a retroviral vector pSUPER?EGFP with DNA recombinant technique. The recombinant vector was identified by the electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The packaging cell Eca109 was transfected with this recombinant plasmid using liposome?based transfection and the stable intergrant was selected by using G418 medium.The expression of stathmin mRNA was detected by RT?PCR in transfected Eca109 cell lines.ResultsThe electrophoresis of EcoRⅠand HindⅢ digested products showed two DNA fragments, 4692 nt and 285 nt, respectively. The result of sequence demonstrated that 64nt had been inserted into the vector. Green fluorescent protein （EGFP）was observed after transfection. G418 resistant clones were also selected. Comparing with control groups the expression of stathmin gene was inhibited obviously in treated groups with pSUPER?S.ConclusionA recombinant retroviral vector pSUPER?S that specific silence stathmin gene and a stable virus?producing packaging cell line were successfully constructed and identified.
Key words：Small interfering RNA; stathmin gene; pSUPER?EGFP vector; Eca109 cells
0引言
食管癌是常见的恶性肿瘤之一。某些基因的异常表达与肿瘤发生、密切相关。Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明[1,2] 通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达，可使细胞受阻于G2／M期，同时使恶性肿瘤表型发生逆转。stathmin成为恶性肿瘤生物的新靶点。RNA干扰是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解相应的细胞内mRNA，使基因转录后沉默[3]。本研究应用含H1启动子的逆转录载体pSUPER?EGFP构建了stathmin基因的siRNA表达载体pSUPER?S，稳定转染Eca109细胞，以特异性沉默目的基因的表达，观察小干扰RNA（siRNA）对靶基因表达的抑制作用，探讨肿瘤基因治疗的新模式。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞系和质粒人食管癌细胞Eca109、大肠杆菌JM109为郑州大学肿瘤中心保存;pSUPER?EGFP质粒由郑州大学基础医学院丁一教授惠赠，靶向stathmin的64nt oligos由上海生物工程公司合成。
1.1.2试剂限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶和Trizol试剂购自Promega公司; DNA Marker、DNA Purification kit和RT?PCR检测试剂盒购自大连宝信生物工程公司；脂质体转染试剂Lipofectine 2000和G418购自美国Invitrogene公司。
1.2方法
1.2.1靶向stathmin基因寡核苷酸的设计应用美国Oligo Engine公司提供的双链RNA（siRNA）设计软件，选择合适的19 nt靶序列，通过Blast搜索确认与人的其他基因序列无同源性。该19 nt的序列分别为：5′?GAAAGACGCAAGTCCCATG?3′，5′?ACGAGAGCACGAGAAAGAA?3′，由上海生物工程公司合成两条64nt的互补单链，序列见表1。
表1两条64 nt的互补单链序列（略）
1.2.2载体的选择选用pSUPER?EGFP质粒为载体，经BglⅡ和HindⅢ两酶切后与合成的64nt的寡核苷酸双链连接，构建重组质粒pSUPER?S。该质粒含有H1启动子，可转录产生shRNA;质粒的报告基因绿色荧光蛋白基因（EGFP基因）和新霉素抗性基因（neo基因）用于阳性克隆的筛选。
1.2.3寡核苷酸与pSUPER?EGFP载体的连接将合成的64nt正义和反义链分别溶于三蒸水中，终浓度为3μg/μl;各取1 μl，加入48 μl退火缓冲液，依次94℃ 4min，80℃ 4min，70℃ 10min，37℃ 20min，最终缓慢冷却至室温进行退火反应。用BglⅡ和HindⅢ双酶切pSUPER?EGFP载体8h。酶切产物于8g/L的琼脂糖凝胶中电泳，用DNA Purification kit回收4913nt的大片段，得到线性化载体。用T4 DNA连接酶分别进行连接反应，重组载体分别命名为pSUPER?S1、pSUPER?S2。
1.2.4连接产物的转化应用1×TSS两步法，将上述连接产物转化至新鲜制备的E.coli JM109感受态细菌中，LB平板（含卡那霉素50 mg/L）上培养10~14 h，选取10~20个中等大小菌落，在含LB液体培养基中37℃振摇10 h，碱裂解法小量提取质粒DNA。
1.2.5重组载体的酶切鉴定用EcoRⅠ和HindⅢ酶切重组质粒及对照空质粒，各取10 μl酶切产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳。对照空质粒双酶切后应观察到227 nt条带，插入64 nt寡核苷酸链，阳性克隆酶切后应观察到285 nt条带。
1.2.6测序鉴定为进一步验证序列的准确性，采用推荐的载体测序引物送北京三博生物公司测序，测序结果应包括64 nt的插入序列，引物序列为:5′?GCGTGAATTCGAACGCTGAC?3′。
1.2.7重组载体转染细胞系Eca109Eca109细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温孵箱中贴壁培养。当细胞铺满培养板底70%时，利用脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒pSUPER?S导入Eca109细胞，48 h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，以1∶5传代培养，24 h后换含G418（600 mg/L）的选择性培养基培养，2~3 d后改用G418（200 mg/L）培养基维持培养，直至阳性克隆形成。成功转染的细胞应呈绿色荧光。
1.2.8转染细胞stathmin mRNA表达的检测收集稳定转染的不同处理组Eca109细胞3×106个，以Trizol试剂提取细胞总RNA。采用AMV一步法RT?PCR试剂盒检测stathmin mRNA的表达。stathmin上游引物：5′?ATGGCTTCTTCTGATATCCA?3′，stathmin下游引物: 5′?GTTCACTTCTATTGCCTTCT? 3′；以β?actin为内参照，上游引物：5′?CCGAGCGCGGCTACAGCTTCA?3′，下游引物：5′?GAAGCATTTGCGGTGGACGAT?3′。产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果并摄像。
2结果
2.1pSUPER?EGFP载体的酶切pSUPER?EGFP空载体经BglⅡ单酶切后载体线性化，大小为4919nt；EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，观察到4692nt和227nt的线性片段；BglⅡ和HindⅢ双酶切，观察到4913nt线性片段，切出的另一6nt片段未能显示。结果与理论值一致，见图1。
M: DL15000 分子量标准; A:pSUPER?EGFP载体BglⅡ单酶切; B: pSUPER?EGFP载体EcoRⅠ、HindⅢ双酶切; C: pSUPER?EGFP载体BglⅡ、HindⅢ双酶切
图1pSUPER?EGFP载体酶切鉴定（略）
2.2pSUPER?S重组载体的酶切鉴定随机挑取LB平板上的菌落摇菌后提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定。重组质粒pSUPER?S用HindⅢ单酶切后线性化，观察到4977nt大小的片段；重组质粒pSUPER?S双酶切后观察到4692nt和285nt的线性片段。结果与理论值一致，见图2。
M:DL15000 分子量标准;A:pSUPER?S载体HindⅢ单酶切; B, C: pSUPER?S1,pSUPER?S2载体EcoRⅠ、HindⅢ双酶切
图2pSUPER?S重组载体酶切鉴定（略）
2.3靶序列测序鉴定 重组质粒pSUPER?S1、pSUPER?S2的测序结果与设计合成的靶向stathmin的64nt寡核苷酸序列完全一致，表明靶向stathmin基因的pSUPER?S1、pSUPER?S2逆转录病毒载体构建成功。
2.4pSUPER?S重组载体稳定转染细胞的筛选重组质粒pSUPER?S经脂质体转染Eca109细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察到有绿色荧光出现。经G418筛选，获得阳性细胞克隆，见图3。
2.5转染细胞stathmin mRNA表达的检测经RT?PCR扩增后，凝胶成像可见内参β?actin扩增片段为545nt，各组电泳条带无明显变化。stathmin扩增片段为270nt，pSUPER?S稳定转染细胞stathmin mRNA的相对表达量较pSUPER?EGFP空载体对照组、空白对照组明显减弱，见图4。
M: DL2000 分子量标准; A: 空白对照组; B:pSUPER?EGFP空载体对照组; C,D: pSUPER?S1、pSUPER?S2载体转染组
图4转染细胞stathmin mRNA表达的检测（略）
3讨论
基因沉默是目前肿瘤基因的一个重要方法，它是在转录和翻译水平阻断基因的异常表达，使肿瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。RNAi是一种转录后基因沉默（PTGS）现象，采用合成的19?23nt siRNA直接转染或shRNA经载体介导转染靶细胞可诱导RNAi，对靶基因mRNA产生特异性降解作用[4,5]。制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、制备siRNA混合物、siRNA表达盒子（SECs）和siRNA表达载体法。前三种方法的作用时间都比较短。siRNA表达盒子是PCR引发siRNA表达模板，SECs依次包含RNA聚合酶启动子、编码shRNA的模板和RNA聚合酶终止点[6]。将带有RNA聚合酶启动子和终止子的PCR引物与合成的DNA模板进行PCR扩增，即可得到大量SECs。siRNA表达载体法是由polⅢ启动体内的转录，另有4~5个T组成的转录终止位点。polⅢ总是在距启动子固定的位置开始转录，在转录终止点的第2个U处终止，非常精确[7]。由于质粒可以在细胞内复制扩增，这种抑制基因表达的效果可持续几周甚至更长，适用于较长周期的研究。食管癌是常见的恶性肿瘤、预后较差，目前对于食管癌的基础研究及临床治疗仍是医学研究热点之一。stathmin基因是从淋巴瘤中筛选出的特征性表达基因，为一种高度保守的胞内蛋白，在细胞周期过程中可被蛋白激酶磷酸化[8]，阻断stathmin磷酸化将使细胞分裂停止于G2/M期[9]。细胞内微管相关蛋白磷酸化过程中stathmin是重要调节因子[10]，直接影响细胞分裂及增殖。stathmin在多种恶性肿瘤细胞中高表达，封闭该基因表达，可以逆转肿瘤的恶性表型[2]。本研究采用基因工程技术利用逆转录病毒转染体系构建了针对stathmin基因的shRNA转录载体pSUPER?S。携带靶序列的pSUPER?S载体是带有新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白编码基因的逆转录病毒载体，该载体带有依赖RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，可转录生成针对靶基因的shRNA，在体内加工生成双链的小干扰RNA，进而降解相应的靶mRNA。逆转录病毒能感染分裂期细胞，使目的基因稳定地整合到靶细胞基因组而长期表达，且不产生辅助病毒，具有很好的安全性。通过脂质体将pSUPER?S逆转录病毒载体转染Eca109细胞，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，说明转染成功。经G418筛选，获得了可长期产生逆转录病毒的Eca109细胞克隆，持续表达针对stathmin基因的shRNA，使靶基因的mRNA降解。为更深入地探讨stathmin基因沉默对食管癌Eca109细胞凋亡和增殖分化的影响，进而应用于食管癌的生物治疗奠定了实验基础。
【】
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