携带BRCA1突变的乳腺癌患者B?淋巴细胞株对辐射敏感性的初步研究
【摘要】 目的 探索BRCA1+/-乳腺癌患者B?淋巴细胞株对辐射诱变的敏感性，以期为建立肿瘤启动与进展机制研究的离体试验系统做一些初步的探索并提供信息。方法 以60Co处理BRCA1+/-乳腺癌患者淋巴细胞株和正常人淋巴细胞株，在含细胞松弛素B的RPMI1640培养液中培养28小时，利用细胞质阻断微核分析（CBMN），评价二个细胞株对γ射线的敏感性。结果 二个细胞株经辐射处理后，主要的基因组不稳定性指标即双核细胞微核率（MNed BNC）和核质桥率（NPB）均显著升高（P<0.01～0.05）；比较二个细胞株的上述指标，没有发现二者间自发与辐射诱发遗传损伤程度的差异。结论 受试BRCA1+/-淋巴细胞株对辐射诱变的敏感性没有显著改变，在本试验系统下，其基因组稳定性与对照细胞株无明显差异。
【关键词】 BRCA1突变 细胞质阻断微核分析 辐射敏感性
0 引言
人类对诱变剂敏感性是肿瘤易感性的一个重要标志[1],具有肿瘤家族倾向的个体的细胞在暴露于离子辐射时，也常表现染色体损伤效应敏感水平的提高，提示其DNA损伤修复过程中某些缺陷的存在[2]。
BRCA1为肿瘤抑制基因，其产物对DNA双链断裂的修复、泛素化作用和染色体重构具有重要作用[3]；涉及中心体复制、纺锤体组装、G2?M期的检查点调节、通过DNA同源重组实施的DNA损伤修复等过程。该基因的缺陷使得受累个体乳腺癌易感性提高，大多数具有家族史的乳腺癌患者携带突变的BRCA1，这些个体对诱变剂尤其辐射往往表现较高的敏感性[4]。然而，由于BRCA1基因含有24个外显子，突变谱复杂，突变引起的生物学效应多样化，了解不同BRCA1突变淋巴细胞株对辐射的诱变敏感性是否高于正常细胞株，有助于建立探索乳腺癌启动和进展相关的遗传改变和机制的离体试验系统，对于预测肿瘤易感性、防护携带该基因突变的高危人群、降低相应的乳腺癌风险具有重要意义；此外，对肿瘤个体的非肿瘤细胞辐射敏感性的检测，也利于识别肿瘤患者正常组织在放疗前对辐射的敏感性[5]。
胞质阻断微核分析（Cytokinesis?block micronucleus assay，CBMN）是评价基因组稳定性的综合技术系统[6]，其通过简便的细胞形态学标准分析，为被检细胞展示的遗传毒性和细胞毒性进行评价。本研究利用该技术评价辐射对受试细胞株的遗传毒性效应，从而加深对不同遗传背景个体、离体与活体细胞对辐射敏感性的理解，为预测肿瘤易感性、研究肿瘤发生机制提供信息。
1 材料和方法
1.1 细胞株
正常人淋巴细胞株（GM12593）和乳腺癌患者淋巴细胞株（GM13705）均为EB病毒转化的高加索人淋巴细胞，源自CCR（Coriell Cell Repositories），由澳大利亚CSIRO Fenech M博士惠赠， GM13705细胞株基因型为BRCA+/-,含有一个BRCA1种系突变，位于第1252密码子，即11外显子。
1.2 实验方法
试验前，以0.5×106的浓度将细胞接种于RPMI1640培养基中（10%小牛血清、100U双抗、2mmol/L L－谷氨酰胺、pH 7.0），48小时后，取750μl细胞悬液接受60Co照射，辐射剂量为1.5Gy(Dose rate 5.91Gy/min, 16sec.), 设置相应非辐射对照，每一处理设置2个重复组；辐射暴露后，加入56μl细胞松弛素B (Sigma, 60μg/ml), 37℃ 培养28小时后1 000r/min 离心,弃上清液，收获细胞。在细胞沉淀中加入约20μl含6% DMSO的小牛血清，温和混匀，室温静置8min，涂片，空气干燥1h，甲醇冰醋酸（3∶1）固定10min，空气干燥，5% Giemsa染液（pH 7.0）染色5min，空气干燥，二甲苯透明，封片，CBMN分析主要集中于双核细胞微核率（MNed BNC）、核质桥（NPB）、核芽（BUD），方法参见[6]。每个处理组分析5 000个以上双核细胞。1．3 统计学方法
以One?way ANOVA分析辐射在GM12593、GM13705细胞株所诱发的遗传损伤变异， 以Student's t?test比较不同细胞株对辐射引起的遗传损伤敏感性之间的差异。
2 结果
经辐射处理后， GM12593和GM13705的MNed BNC和NPB频率均显著高于自身未经辐射处理的对照（P<0.05）；辐射诱发的BUD频率在二个细胞株都表现升高趋势，GM12593的BUD频率比未辐射时提高2.4倍，GM13705提高2.2倍，但均未达到显著性差异水平, 见表1。比较二个细胞株上述三个遗传损伤指标所出现的变化，尽管GM13705的 MNed BNC频率高于GM12593（分别为248.86‰和180.75‰）,但无显著性差异，NPB和BUD指标亦然，见图1。表1 γ辐射诱发BRCA+/-乳腺癌
3 讨论
迄今为止，对不同个体和细胞的辐射敏感性差异机制的了解很少。一般认为，其受DNA修复基因、细胞周期检查点控制、细胞凋亡、细胞内辐射响应事件等多因素的影响。作为肿瘤抑制基因，BRCA1产物对DNA双链断裂的修复、泛素化作用和染色体重构具有重要作用[3]；大量研究提示，携带BRCA1突变的乳腺癌细胞对电离辐射和引起DNA修复缺陷的诱变剂表现高度敏感[4]，相应的淋巴细胞自发微核率也高于正常细胞[1,7]，这些细胞的基因组不稳定特性与肿瘤的高风险之间有很高的相关性。显然，对起源于BRCA+/-淋巴细胞的永久细胞株是否具有类似特性的探索，有助于建立探索乳腺癌启动和进展相关的遗传改变和机制的试验系统。
CBMN是评价基因组稳定性的综合技术系统，其提供了染色体断裂、重排、染色体分离异常、基因扩增、细胞坏死与凋亡等遗传毒性和细胞毒性系列指标[6,8]。本文通过CBMN技术评价了BRCA+/-的乳腺癌患者淋巴细胞株对辐射的敏感性，旨在为建立家族性乳腺癌发病机制研究的离体试验系统做一些初步的探索并提供信息。
研究发现，所施用的辐射剂量，无论在对照细胞株和来源于乳腺癌患者的BRCA+/-的淋巴细胞株，都显著诱发MNed BNC、NPB的显著增加，这一结果与辐射的诱变效应相符合；然而，在比较二个细胞株是否对辐射具有不同的遗传响应时，未发现二者被观察的遗传损伤指标间有显著差异。Trenz K等[9]人利用携带BRCA1不同突变和正常淋巴母细胞株（lymphoblastoid cell line, LCL）的研究发现，辐射后BRCA1突变细胞株未表现明显的BRCA1表达量的改变。鉴于BRCA+/-表达量取决于突变的等位基因是否引起转录功能的异常[10]，而该基因产物又在同源重组介导的DNA损伤修复过程中发挥着重要作用，本试验所使用的GM13705细胞株对辐射所表现的常规响应类同于正常细胞的事实提示辐射对本细胞株DNA损伤修复能力无明显抑制，推测对BRCA1基因的表达亦无显著影响。进一步研究需要对本细胞株在辐射条件下的BRCA1表达量和产物结构做细致的研究。就目前所获得的结果提示，本试验所用的BRCA+/-的乳腺癌患者淋巴细胞株在进行诱变剂与肿瘤发生与的关系研究中存在一定的局限性。
【】
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