PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及 对子宫颈癌细胞的干预性研究

                   作者：黄浩　凃欣，余南才，吴文莉，刘倩，马威，郝建军，易艳东

【摘要】  　　目的 构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在 Hela细胞表达，同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法 将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil?1,构建真核表达质粒pGenesil?1?PCNA1?4，并通过酶切和测序等方法进行鉴定，将真核表达质粒pGenesil?1?PCNA1?4转染子宫颈癌细胞，运用Western blot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长，阻滞细胞G0/G1—S期，PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现，实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因奠定了基础。

【关键词】  子宫颈癌　增殖细胞核抗原　小发夹结构RNA　子宫颈癌细胞

　Constructed Eukaryotic Expression Plasmid of Small Hairpin RNA （shRNA） of PCNA and Investigated the Inhibitory Effect on Hela Cell

      Key words：Uterine cervix carcinoma；Proliferating cell nuclear antigen；Small hairpin RNA；Hela cell

　肿瘤的发生与基因突变及细胞增殖有关。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是在细胞周期S期广泛表达的一种核蛋白,是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36KD多肽, 其功能是DNA聚合酶δ的重要辅助蛋白,在DNA合成中是绝对必需的,在细胞增殖过程中有重要意义, PCNA阳性表达说明该细胞正处于增殖状态。因此, PCNA作为一项评估细胞增殖状态的指标不仅用于病研究,而且近年来在肿瘤研究中的应用日渐增多［1］。

    RNA干预（RNA interference,RNAi）本质是一种双链RNA（double?stranded RNA,dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默［2］ (post?transcriptional gene silencing,PTGS)。shRNA是45-50?mer的小发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA），通过将其转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制［3］。

    图1  真核表达载体pGenesil?PCNA?1?4的构建

    我们根据PCNA的cDNA的序列设计shRNA的引物，插入真核表达载体pGenesil?1,构建正确的真核表达质粒，见图1，导入Hela细胞中并研究其产生siRNA对Hela细胞干预的影响。为RNAi干预技术对肿瘤的基因治疗提供了实验理论和基础。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    HeLa细胞引自武汉大学生命院,培养于含10％小牛血清的DMEM的培养液中，37℃ 5％的CO2条件下培养，0.3％的胰酶消化和传代。

    1.2  shRNA设计和合成

    根据PCNA基因序列(NM_182649)， shRNA设计规则及blast同源搜索选取、设计四对引物及一对对照引物,每一对引物上游含BamHⅠ切点之后GATCC的粘性末端，引物下游互补端含HindⅢ切点的互补的TTCGA粘性末端，武汉市晶赛生物技术有限公司合成。

    1.3  PCNA的shRNA的真核表达载体的构建

    将真核表达载体pGenesil?1和经BamHⅠ，HindⅢ双酶切后与纯化的含相应粘性末端的PCNA基因的shRNA四对引物片段和一对对照引物片段,进行线性连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经小量提取质粒测序鉴定。构建的表达质粒称pGenesil?PCNA?1、pGenesil?PCNA?2、pGenesil?PCNA?3、pGenesil?PCNA?4、pGenesil?PCNA?HK。

    1.4  阳离子聚合物（梭华－SofastTM/DNA试剂盒）介导的细胞转染

    细胞培养至40%～60%汇合，配制不同浓度的pGenesil?PCNA?1?4（浓度 5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml）梭华－SofastTM/DNA复合物，进行转染，具体操作步骤见试剂盒说明书。

    1.5  流式细胞仪(FCM)检测

    收集1.0×106细胞,用70%冷乙醇固定,加rNaseA (终浓度50μg /ml),用37℃水浴1h,加碘化丙啶(PI,终浓度20μg/ml),暗处冰浴染色1h。用流式细胞仪检测细胞周期分布,用通过ModFitLT3.1软件分析。

    1.6  Western?blot定量检测PCNA蛋白

    转染细胞如1.4，收集转染及正常的细胞，裂解液裂解,取20μl裂解样品液,进行SDS?PAGE蛋白电泳，表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，进行Western?blot反应，通过BandScan5.0软件对杂交图进行分析，以β?actin做为定量Marker，20pmol为定量单位。

    1.7  统计学分析应用

    t检验进行差异分析,以P<0.05为差异有显著性意义。

    2  结果

    2.1  PCNA shRNA 对细胞增殖的影响

    2.1.1  细胞光镜观察见图2、3。由上图可知正常细胞呈致密的上皮，在转染了四种引物的真核表达载体24h后，细胞都发生显著变化，周边细胞脱落死亡，细胞形态呈梭形，中间细胞聚集成团，类似于孤岛状。

    2.2  流式细胞仪(FCM)检测细胞周期  见图4A、B。

    图4  A:未转染的Hela细胞24h后细胞周期分析；B:转染pGenesil?PCNA?4，12.5mg/ml,24h后细胞周期分析

    通过ModFitLT3.1软件分析以上细胞周期图，正常Hela细胞24h后， G0～G1期占37.46%，S 期39.23%，G2?M期23.31%，转染12.5μg/ml pGenesil?PCNA?4 24h后G0～G1期占57.23%，S期29.12%，G2?M期13.65%。

    在分析pGenesil?PCNA?1?4各组转染的肿瘤细胞中,我们发现G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少, 在转染pGenesil?PCNA?4时G2期细胞数明显减少。

    2.3  Western?blot检测PCNA蛋白

    各种质粒转染12.5μg/ml时Western?blot杂交图，见图6。

    图6  Western?blot杂交图

    由图6可知，没有转染的正常Hela细胞和转染了pGenesil?PCNA?HK、pGenesil?PCNA?1?4质粒的Hela细胞均可见在43KD的β?actin Marker略下方可见清晰杂交带,我们将没有转染的正常Hela细胞与转染12.5μg/ml时的 pGenesil?PCNA?HK、pGenesil?PCNA?1?4的24h后western?blot杂交图进行 BandScan5.0软件分析，以β?actin为内参定量Marker，得出结果分别为11.84、11.32、1.14、4.43、1.14、0.51,转染了四种真核表达的质粒细胞表达PCNA的蛋白量均显著降低，其中转染pGenesil?PCNA?4最显著。

    3  讨论

    子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它严重威胁妇女的生命健康,但其发病机制尚不清楚。已有很多资料表明：子宫颈癌PCNA表达率明显高于非癌性子宫颈上皮,且在子宫颈癌中PCNA表达率随分化程度的降低而增高,表明PCNA的表达能作为反映子宫颈癌细胞增殖活性的指标［4］。

    利用反义技术特异地阻断某一基因功能已被证实是可行的。应用反义技术封闭PCNA的研究，目前主要集中在研究增殖性血管性疾病，仅有少数报告研究增殖性肾病和胃癌的［5］。但至今未见应用PCNA的shRNA技术封闭Hela细胞增殖的报道。

    实验中我们通过流式细胞术分析细胞周期发现pGenesil?PCNA?1?4各组转染的肿瘤细胞中,G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少,G2期细胞数减少，pGenesil?PCNA?4组减少最显著。提示pGenesil?PCNA?1?4可能延缓了肿瘤细胞由G1期向S期的过渡。证实我们构建的shRNA真核表达载体都具有有效性。

    我们通过Western blot及BandScan5.0软件分析了转染5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml各种浓度的pGenesil?PCNA?1?4，将结果与对照组比较，发现表达PCNA蛋白量均有显著性差异。转染pGenesil?PCNA?4组的PCNA蛋白量降低最为显著，转染各种浓度质粒的PCNA蛋白表达量均明显下降，进一步证实了我们构建的四种shRNA真核表达载体均具有有效性，其中，pGenesil?PCNA?4的有效性最好。实验结果表明: 我们设计的四种PCNA的shRNA不仅抑制了Hela细胞的生长、DNA和PCNA蛋白合成，而且明显阻滞了Hela细胞由G0/G1期进人S期。而相同浓度的对照pGenesil?PCNA?HK对Hela生长无明显抑制作用，提示PCNA的shRNA对Hela细胞抑制作用具有特异性。

    应用PCNA基因shRNA阻断特定的基因表达，可以明显抑制Hela细胞的增殖，改变肿瘤细胞的生物学行为，为合理地利用反义技术改变和逆转致病瘤细胞恶性表型的肿瘤基因治疗提供了一个方向。

【】
  　　［1］ Li L, Da J, Stucki M, et al. Int J Antiproliferative activity and toxicity of 2?methoxyestradiol in cervical cancer xenograft mice［J］. Gynecol Cancer, 2005,15(2):301?307.

［2］ Kuninger D, Stauffer D, Eftekhari S, et al. Gene disruption by regulated short interfering RNA expression, using a two?adenovirus system［J］ Hum Gene Ther, 2004, 15(2):1287?1292.

［3］ Spankuch B, Matthess Y, Knecht R, et al. Cancer inhibition in nude mice after systemic application of U6 promoter?driven short hairpin［J］. J Natl Cancer Inst, 2004,96(11):862?872.

［4］Arrighi JF, Pion M, Wiznerowicz M. Lentivirus?mediated RNA interference of DC?SIGN expression inhibits human immunodeficiency virus transmission from dendritic cells to T cells［J］. J Virol, 2004,78(20):10848?10855.

［5］ Hasan S, Stucki M, Hassa PO. Regulation of human flap endonuclease?1 activity by acetylation through the transcriptional coactivator p300［J］. Mol Cell, 2001,7(6):1221?1231.