血管内皮生长因子受体?3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究
作者：刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣
【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子受体?3（VEGFR?3）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 用基因重组方法构建人反义VEGFR?3基因真核表达载体，用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用Western Blot分析转染前后细胞中VEGFR?3蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果 转染反义VEGFR?3质粒后, Hela细胞VEGFR?3的蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论 抑制VEGFR?3的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡，VEGFR?3可能是肿瘤基因的一个潜在新靶点。
【关键词】 VEGFR?3 反义核酸 凋亡；宫颈癌
The Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor?3 on the Apoptosis of Cervical Cancer
Key words：VEGFR?3；Antisense nucleic acid；Apoptosis；Cervical cancer
血管内皮生长因子受体?3(VEGFR?3)属于酪氨酸激酶受体家族, 在胚胎发生的初始阶段存在于所有的内皮细胞，随后定位于小静脉和淋巴管，是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标志物[1]。VEGFR?3主要通过与其配体VEGF?C、VEGF?D结合后，促进淋巴内皮细胞的增殖、分化，诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。在肿瘤组织中可见肿瘤周边的新生淋巴管、扩张的淋巴管、有癌栓的淋巴管内皮细胞VEGFR?3呈高表达[3]。
现有研究表明VEGFR?3在多数肿瘤细胞上也有相应表达[4]，但关于其在肿瘤细胞中的效应及作用机制尚不清楚。我们自行设计了VEGFR?3的反义重组质粒，通过电穿孔转染法瞬时转染人宫颈癌细胞株Hela细胞，观察反义封闭VEGFR?3后Hela细胞凋亡情况的变化，对VEGFR?3在宫颈癌细胞中的作用及其机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与仪器 培养基DMEM、Trizol购自美国Gibco BRL公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；M?MLV逆转录酶、pGEM?T载体购自美国Promega公司；PCR引物购自上海博亚生物技术有限公司；兔抗人VEGFR?3 多克隆抗体、兔抗人β?actin多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa Cruz公司；ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司。
1.1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞株Hela购自美国典型物种保藏中心（ATCC）, 培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。
1.2 VEGFR?3反义核酸载体的构建
1.2.1 VEGFR?3目的基因的制备 根据NCBI Genebank 登录的VEGFR?3的cDNA序列, 利用Primer5.0设计VEGFR?3胞外1～3区的引物，上游引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计EcoRⅠ酶切位点，上游引物序列为：5’?GGATCCGACGGCCTGGTGAGTGACTA?3’下游引物序列为：5’?GAATTCCTTTGAGCCACTCGACGCTGATGA?3’。按Trizol说明书从胎盘组织中提取总mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济妇产科提供)，再以RT?PCR方法大量扩增VEGFR?3目的片断。PCR循环条件：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、56℃复性30 s、72℃延伸45 s，共35个循环，全部循环结束后，于72℃做10 min终止前延伸。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化试剂盒纯化目的片断。
1.2.2 反义VEGFR?3重组质粒的构建 按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆, 小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。
1.3 基因转染及细胞分组
《分子克隆》采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至已加入适量培养基的35mm培养皿中，培养皿置于含5％CO2的37℃孵箱, 24h后观察转染效率。
细胞分组：空白组（不做处理的Hela细胞），对照组（转染空质粒pGFP?C1的Hela细胞），实验组（转染反义质粒的Hela细胞）。
1.4 WesternBlot分析转染前后细胞VEGFR?3蛋白的表达
分别提取空白组细胞、转染空载体及转染反义质粒48h的Hela细胞总蛋白，参考《分子克隆》实验方法，按ECL显色试剂盒说明书曝光成像。
1.5 转染细胞生物学效应的观察
1.5.1 Hoechst33258观察转染前后细胞形态学的变化 将空白组、对照组和实验组的Hela细胞分别置于预先放入玻片的六孔板中，待24 h后取出玻片，PBS漂洗，固定，待干燥后由Hoechst33258室温避光染色30min，封片后荧光显微镜观察。
1.5.2 流式细胞法检测Hela细胞凋亡率 分别收集空白组、对照组和实验组48h后的Hela细胞，常规方法行PI染色后，上机检测。
1.6 统计分析 Hela细胞凋亡率以±s表示，用t检验在SPSS11.5统计软件上分析差异显著性，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGFR?3反义表达载体构建及鉴定
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，970bp处有明显扩增条带，其大小与预期目的基因片段相吻合，构建的VEGFR?3 反义表达载体经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切产生了两条带：载体pEGFP?C1片断（4.7kb）和目的片断（970bp）。对酶切正确的质粒进行测序，结果表明其序列与插入方向正确，见图1。
1:1kb DNA 标准； 2:VEGFR?3 PCR 产物 （970bp）；3:双酶切产生的条带，可见目的条带（970bp）和载体片断（4.7kb）
图1 构建质粒的酶切鉴定
2.2 电穿孔法转染Hela细胞效率的鉴定
荧光显微镜下观察，对照组和实验组的Hela细胞可见绿色荧光，通过高倍镜（200×）计数至少3个视野EGFP发光的细胞数与该视野总细胞数的比值来得到基因的转染率，本研究基因转染率约为30％～40％。
2.3 VEGFR?3蛋白的表达
Western bolt分析转染反义表达载体前后Hela细胞中VEGFR?3蛋白的表达结果显示，三组细胞中均有VEGFR?3蛋白表达（120KD），但空白组和对照组比较无显著差异，而实验组Hela细胞VEGFR?3蛋白表达明显减弱，见图2。
图2 Western Blot检测空白组（A），对照组（B）及
实验组（C）中VEGFR?3的表达
2.4 Hoechst33258染色
荧光显微镜下（×200）观察，未经处理Hela细胞和转染空载体的Hela细胞核较大，呈弥散均匀荧光，而转染反义VEGFR?3重组质粒的细胞核较小，可见浓染致密的颗粒状荧光，并呈现凋亡核固缩形态（图略）。
2.5 流式细胞仪对Hela细胞凋亡的分析
反义VEGFR?3重组质粒或空载体转染Hela细胞48h后，应用流式细胞仪对Hela细胞进行凋亡分析，结果显示：转染反义质粒后，Hela细胞凋亡率由(0.48±0.02)％增加至(8.6±0.21)％，与空白组和对照组相比，差异均具有极显著性（P<0.01），见表1。表1 质粒转染后Hela细胞凋亡的变化注：*与对照组相比，P<0.01
3 讨论
VEGFR?3属于酪氨酸激酶受体家族，为一个高度糖基化的单链跨膜蛋白，分子量为180kD，有3部分组成，一个胞外区（配体结合区），一个跨膜区和一个胞内区（蛋白激酶活化区）。其中胞外区为7个免疫球蛋白样超二级结构，而且第2个Ig同源区为其与配体结合的区域[5]。VEGFR?3和其特异性配体VEGF－C/ VEGF－D结合后，发生磷酸化，可能通过激活PI3K/Akt和p42/p44 MAPK信号通路，对淋巴管内皮细胞产生特异性的致分裂作用，促使淋巴内皮细胞分裂增殖, 促进淋巴管新生[6]。
国内外多数研究表明，VEGF?C/ VEGFR?3在肿瘤周边的新生淋巴管内皮细胞呈高表达，与肿瘤的淋巴结转移呈高度相关；VEGF?C可通过与VEGFR?3结合而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，阻断VEGF?C或VEGFR?3的作用，能够抑制肿瘤的淋巴道转移[7?9]。
VEGFR?3在多数肿瘤细胞的表面也有相应的表达, 这可能与肿瘤细胞自分泌各种生长因子有关，但其对肿瘤细胞的效应目前尚不清楚。多数研究表明，VEGFR?3胞外1～3区为其与配体结合所必需区段，阻断该区的表达，就可抑制VEGFR?3和配体的结合，进而阻断其后续的信号传导通路[10]。因此，本实验设计了带有报告基因GFP的VEGFR?3胞外1～3区的反义核酸，转染人宫颈癌Hela细胞，转染后的细胞经Western Blot检测其VEGFR?3蛋白表达明显减弱；同时发现，转染VEGFR?3反义核酸的Hela细胞与空转载体的Hela细胞相比，差异具有极显著性（P<0.01）,提示VEGFR?3在肿瘤细胞的增殖分化中同样也起到重要的作用。
总之，我们的研究结果提示，VEGFR?3反义核酸可以促进宫颈癌细胞的凋亡，推测可能是通过降低宫颈癌细胞VEGFR?3的表达，继而抑制VEGFR?3所介导的信号通路发挥作用。虽然其作用机制还需进一步探讨，但我们认为，应用VEGFR?3反义核酸既可阻断肿瘤的淋巴道转移，又可促使肿瘤细胞凋亡，不失为未来临床抗肿瘤的一个新的选择。
【】
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