乳腺癌组织和癌旁组织MGMT和GST?π蛋白表达的流式细胞术分析
作者：左文述，魏玲，宋现让，王兴武于志勇，毕晔
【摘要】 目的 研究乳腺癌组织和癌旁组织O6?甲基鸟嘌呤? DNA甲基转移酶（MGMT）和谷胱苷肽S?转移酶?π（GST?π）蛋白表达的临床意义。方法 应用流式细胞术（FCM）分析MGMT和GST?π蛋白表达。结果 乳腺癌组织MGMT和GST?π表达显著高于癌旁组织（P<0.05）。2种耐药相关蛋白在不同年龄、不同肿瘤大小、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达均无显著差异（P>0.05）。有淋巴结转移组患者MGMT与无淋巴结转移组患者比较无显著差异（P>0.05）。但GST?π表达在有淋巴结转移组患者显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。相关分析显示，MGMT与GST?π表达间无显著相关性（P>0.05）。结论 初步研究结果提示，MGMT蛋白表达可能与乳腺癌预后无关，不能作为乳腺癌的一个预后指标。GST?π表达与淋巴结转移状况有关，有可能成为预测乳腺癌预后的指标之一。
【关键词】 MGMT；GST?π；乳腺肿瘤；流式细胞术
The Analysis of MGMT and GST?π Protein Expression Detected by Flow Cytometry in Breast Carcinoma Tissues and Corresponding Para?Carcinoma Tissues
Key words：MGMT;GST?π ;Breast tumor; Flow cytometry
O6?甲基鸟嘌呤?DNA甲基转移酶(O6?methylguanine?DNA methyltransferase,MGMT) 是从细菌到哺乳类机体中存在的一种独特的DNA修复蛋白，它可修复由烷化剂诱导而形成的O6?烷基鸟嘌呤DNA加合物，减轻细胞DNA烷基化损伤，导致细胞对烷化剂类化疗药物产生耐药性。谷胱苷肽S?转移酶?π（GST?π）是GSTs家族的主要成员，研究发现GST?π高表达与肿瘤耐药关系密切，可能是多药耐药标志之一。迄今尚未见应用流式细胞术（FCM）同时定量检测乳腺癌中MGMT和GST?π蛋白表达的研究报道。为进一步明确MGMT和GST?π在乳腺癌中的表达意义，本研究检测了其在乳腺癌组织中的表达情况，并探讨与患者临床病理特征等因素间的关系。
1资料与方法
1.1临床资料
118例乳腺癌患者均为山东省肿瘤2002年10月～2004年12月外一科住院病例。患者女性，年龄21～74岁，中位年龄51.6岁，全部行乳腺癌改良根治术或根治术。肿瘤直径＞1.5cm，留取癌组织和距癌边缘1cm以上的癌旁腺体组织。患者全部经病理证实且术前未接受任何放、化疗治疗及其他治疗。组织学分类按照WHO（2003年）分类，包括浸润性导管癌95例，其他类型23例（浸润性小叶癌16例、髓样癌5例、粘液癌2例）。临床分期根据UICC （1997年）分期标准：Ⅰ、Ⅱ期92例，Ⅲ期26例。有腋淋巴结转移者82例，无腋淋巴结转移36例。
1.2细胞免疫荧光染色的样品制备
用组织搓网法制成单细胞悬液，70%冷乙醇4℃固定24h，用含1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤2次，调浓度为1×106/ml。二步法进行免疫荧光染色，100μl细胞悬液先加MGMT单抗（Chemicon，1:40）或GST?π单抗(B?D Pharmingen,1:10)10μl。室温避光反应30min后加二抗FITC?IgG1（B?D Pharmingen，1:10）5μl，室温避光反应30min后上机检测。
1.3FCM条件
B?D公司FACS Calibur型流式细胞仪，蛋白表达以相对荧光强度（RFI）表示。RFI=加单抗管细胞平均荧光强度/同型对照管细胞平均荧光强度。
1.4统计学分析
采用SPSS 10.0软件，组织耐药相关蛋白表达呈非正态分布，表达用中位数（Median），比较用秩和检验。相关性采用Pearson相关分析。
2结果
2.1乳腺组织中MGMT和GST?π蛋白表达
乳腺癌组织MGMT和GST?π表达分别为1.00～8.26和0.12～18.38，中位数分别为2.84和1.07；相应癌旁组织2种蛋白表达分别为0.67～2.15和0.28～1.34，中位数分别为1.24和0.68。经秩和检验，乳腺癌组织耐药相关蛋白表达与相应癌旁组织比较差异均有显著意义（P<0.05），见图1、2。 表1MGMT蛋白表达与乳腺癌临床病理因素的关系由表1和表2可见，2种耐药相关蛋白在不同年龄、不同肿瘤大小、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达均无显著差异（P>0.05）。有淋巴结转移组患者MGMT与无淋巴结转移组患者比较无显著差异（P>0.05）。但GST?π表达在有淋巴结转移组患者显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。表2GST?π蛋白表达与乳腺癌临床病理因素的关系
2.3耐药相关蛋白表达的相关性
Pearson相关分析显示，MGMT与GST?π蛋白表达未显示相关性（P>0.05）。
3讨论
3.1MGMT在乳腺癌组织中的表达意义
有关MGMT在其他肿瘤中的研究较多，但在乳腺癌组织中的研究报道相对较少。本结果显示乳腺癌组织MGMT表达高于相应癌旁组织，与有关报道一致［1,2］。在与临床病理因素的关系上，发现MGMT在不同年龄、不同肿瘤大小、不同病理类型、不同临床分期和ER、PR阴性与阳性患者间均无差异，与Clemons等[3]的结果相似，提示MGMT表达可能与乳腺癌患者的预后无关，尚不能作为乳腺癌的一个预后指标。但也有相反报道，如Citron等[4]发现MGMT与乳腺癌淋巴结转移有关，而与年龄、ER状态无关。Cayre等[5]检测新辅助化疗前乳腺癌患者MGMT表达，发现MGMT低表达与S期细胞比例增加、ER阴性、转移和生存期短有关。
3.2GST?π在乳腺癌中的表达意义
本研究发现乳腺癌组织GST?π表达高于相应癌旁组织，与有关报道一致[6，7]，提示GST?π表达增加可能与乳腺癌发生及进程有关。同时，GST?π表达与患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期和ER、PR表达状况均无关，但与淋巴结转移有关,与[8]相似。但也有相反研究结果，如Huang等[9]发现GST?π与任何临床病理因素均无关，但GST?π阳性肿瘤更具侵袭性，患者无瘤生存期短、预后差。Gilbert等[10]发现GST?π表达与肿瘤大小、淋巴结转移、核分级、组织学类型及年龄均无关，但与ER、PR表达状况呈负相关性。对部分淋巴结转移阴性乳腺癌患者的研究显示，GST?π表达增加与无瘤生存期和总生存期降低有关。
3.3基因表达的相关性
经相关分析未发现MGMT与GST?π表达有相关性。由于检测方法和肿瘤具有异质性等因素的影响，目前对此两种耐药基因在乳腺癌组织中的表达意义结论不一。鉴于耐药基因高表达者更易对多种化疗药物产生耐受性，因此对MGMT和GST?π联合高表达者应提高警惕，可考虑加用MDR逆转剂如异搏定或配合耐药基因的反义寡核苷酸以期改善预后。
【文献】
［1］ Musarrat J,Wilson JA,Wani AA.Localization of O6?alkylguanine transferase in cancer susceptible cells of human female breast[J].Cancer Lett,1996,108(1):111?118.
[2]Wani G,D'Ambrosio SM.Expression of the O6?alkylguanine?DNA alkyltransferase gene is elevated in human breast tumor cells[J].Anticancer Res,1997,17(6D):4311?4315.
[3]Clemons MJ,Bibby MC,El Teraifi H,et al.Heterogeneity of O6?alkylguanine DNA?alkyltransferase expression in human breast tumours[J].Br J Cancer，2002，86(11):1797?1802.
[4]Citron M,Schoenhaus M,Rothenberg H,et al.O6?methylguanine?DNA methyltransferase in normal and malignant tissue of the breast［J］.Cancer Invest,1994,12(6):605?610.
[5]Cayre A,Penault?Llorca F,De Latour M,et al.O6?methylguanine?DNA methyl transferase gene expression and prognosis in breast carcinoma[J].Int J Oncol,2002,21(5):1125?1131.
[6]Sreenath AS,Kumar KR,Reddy GV,et al.Evidence for the association of synaptotagmin with glutathione S?transferases: implications for a novel function in human breast cancer[J].Clin Biochem,2005,38(5):436?443.
[7]El?Rayes BF,Ali S,Heilbrun LK,et al.Cytochrome p450 and glutathione transferase expression in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2003,9(5):1705?1709.
[8]Colovai AI,Stoica A,Cinca SA,et al.Glutathione S?transferase activity in human breast tumors[J].Neoplasma,1992,39(4):249?254.
[9]Huang J,Tan PH,Thiyagarajan J,et al.Prognostic significance of glutathione S?transferase?pi in invasive breast cancer[J].Mod Pathol,2003,16(6):558?565.
[10]Gilbert L,Elwood LJ,Merino M,et al.A pilot study of pi?class glutathione S?transferase expression in breast cancer: correlation with estrogen receptor expression and prognosis in node?negative breast cancer[J].Clin Oncol,1993,11(1):49?58.
