染色体2p22的过度扩增及hmsh2基因的高表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的研究

          作者：李红霞,关新元,张素梅,尹冬梅

【摘要】  目的 研究染色体特定区域DNA拷贝改变、基因差异表达及其与紫杉醇耐药的关系。方法 运用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）及RT?PCR技术，分析卵巢癌紫杉醇耐药株染色体基因组变化和hmsh2基因在卵巢癌组织中的表达。结果 CGH结果显示最有意义的变化是卵巢癌紫杉醇耐药株OC3/Tax300细胞染色体2p22过度扩增。RT?PCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达。hmsh2基因表达阳性率在组1和组2分别为93.9%（31/33）及47.6%（10/21），差异有显著性;在低分化癌为93.3%，显著高于中、高分化癌的54.2%。结论 2p22拷贝数的过度扩增及hmsh2基因的高度表达可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。

【关键词】  卵巢癌；紫杉醇耐药细胞系；比较基因组杂交；hmsh2基因

 基金项目：首都医学科研基金(重点学科)资助项目（ZD199915）

    Study on the Relationship of Taxol?resistance of Ovarian Carcinoma with the Amplification of 2p22 on Chromosome and the Expression of hmsh2 Gene.

    Key words：Ovarian carcinoma;Taxol?resistant cell lines;CGH; hmsh2 gene

    卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。目前，在其方面，紫杉醇以其确切的疗效已成为应用最广泛的化疗药物之一，且与顺铂、阿霉素之间无交叉耐药，已成为治疗卵巢癌的一线药物。但随之而来的耐药问题成为临床治疗的障碍，严重制约了卵巢癌病人的疗效。解决这一难题的关键在于揭示其耐药机制，为进一步进行临床逆转耐药及预防耐药的研究提供基础，最终达到预防和逆转耐药的发生，改善卵巢癌的治疗效果，提高患者的生存率。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞株与细胞培养  紫杉醇耐药细胞株亲代细胞OC3由人民解放军军事医学院分子生物学实验室李春海教授惠赠,本室传代培养保存；两种紫杉醇耐药细胞株：OC3/Tax300 及OC3/Tax50由本室以不同剂量的紫杉醇诱导建立[1]。细胞生长于含有10%胎牛血清的RPMI?1640培养基，在37℃、5% CO2的培养箱中传代培养；用0.25%胰酶消化传代，12h细胞即可贴壁，约24h后进入指数生长期，每2～3天传代一次。

    1.1.2临床标本  选择2000年3月～2005年5月间北京世纪坛妇科实验室所收集的卵巢癌标本54份（均冷冻保存于液氮中），其中分为2组：术前使用紫杉醇先期化疗者、或因复发而行二次手术者共33份（组1）;术前未经任何药物化疗者21份（组2）。标本的组织学类型：浆液性卵巢癌26份，粘液性卵巢癌21份，子宫内膜样癌7份；组织学分级：低分化癌30份，中、高分化癌24份。

    1.2方法

    1.2.1比较基因组杂交

    常规酚－氯仿法提取耐药株、敏感株的DNA和健康女性外周血基因组DNA。制备健康女性淋巴细胞中期染色体。以切口平移法,用荧光素－dUTP （绿色荧光）标记敏感株和耐药株DNA，罗丹明－dUTP （红色荧光）标记配对的正常外周血DNA。染色体玻片预处理后，分别与标记的待测DNA探针和参照DNA探针杂交。荧光显微镜下观察染色体上不同的荧光，荧光图像分析系统摄取并比较红绿两种荧光的强度，得出两组DNA的荧光比率和分析图。

    1.2.2RT?PCR扩增

    参照[2]设计hmsh2引物序列，由上海生工生物有限公司合成。上游：5’? caa ttg aaa gga gtc tcc acg ?3’ (21bp) 下游: 5’? aaa ctc ctc aag ttc cag gg ?3’ (20bp)，扩增片段长度为411bp。细胞及组织RNA提取参照TRIzol Reagent （life technologies）试剂盒说明书进行。PCR反应体系：10×缓冲液2μl,10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）1.5μl,25mmol/L MgCL2  2.4μl,上、下游引物各2μl,cDNA 1μl,Taq酶0.1μl，加去离子水9μl至终体积20μl。反应条件为：94℃ 5min预变性；然后95℃变性50s,55℃退火1min,72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳。

    1.2.3统计学分析

    χ2检验及Fisher精确检验。

    2结果

    CGH结果显示紫杉醇敏感株细胞和两种耐药株细胞的遗传物质均有不同程度的改变，涉及10条染色体,见表1。遗传物质表达丢失的有：1，3p，4，6，7q，8p号染色体；表达增加的有：2p22，3q，5p，9，10号染色体。仅在敏感株OC3中表达增强的是10号染色体；表达缺失的是7q，8p。3p缺失发生在OC3和耐药株OC3/Tax300。敏感株和耐药株OC3/Tax50的10q22表现为高度扩增。2p22仅在耐药株OC3/Tax300中为高度扩增，见图1。

    3讨论

    体外培养的细胞系以其清晰的遗传背景，丰富的来源，成为研究某些类型癌基因及其功能改变的必要工具，并且这些细胞系具备与原发肿瘤相同的遗传学特点和分子生物学性状[3]。本研究所用的两种紫杉醇耐药细胞系OC3/Tax300、OC3/Tax50是参照临床化疗的剂量和给药方式设计诱导而建成。OC3/Tax300细胞株耐药性稳定，耐药指数为6.70，对拓朴替康有明显的交叉耐药。之前曾有学者分别用长春新碱、紫杉醇及阿霉素对亲代细胞进行体外诱导建立耐药细胞系，并利用CGH、FISH等技术将亲代细胞和子代细胞的染色体变化进行检测，发现一些染色体的异常变化与耐药有关。如 6q21?25拷贝数的增加，7q21?36和 10q12?15拷贝数的减少参与铂类耐药；7q11.2?21的拷贝数增加与紫杉醇耐药相关[4?6]。CGH是一种全方位检测法，一次杂交试验即可在整个基因组水平对不同基因组间DNA序列拷贝数差异进行检测并定位。利用这项技术可以对不同类型的肿瘤、同一肿瘤的不同阶段的遗传物质的改变进行检测。本研究发现三种细胞株均存在遗传物质的不平衡变化。通过对比分析发现耐药细胞OC3/Tax300的2p22呈现特异性高水平扩增。

    染色体2p22上存在肿瘤耐药相关基因，如错配修复（MMR）家族中的hmsh2基因[7，8]。正常情况下，DNA双螺旋结构是靠A?T,C?G间的氢键互补配对来维持，如果因各种原因使得DNA之间的碱基互补配对发生错误形成了DNA错配时，机体会对错配了的碱基进行修复以保证DNA复制的忠实性和维持基因组的稳定性。具备这种作用的基因就是错配修复基因。进一步RT?PCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达，在OC3/Tax50细胞呈弱表达，而在OC3细胞未见表达；在临床紫杉醇化疗后标本中hmsh2基因表达率显著高于未经化疗组，均表明该基因的过度表达与紫杉醇耐药有关。推测其机制可能是：化疗药物导致肿瘤细胞的DNA损伤，此时由某种途径激活hmsh2基因，使其修复作用增强，不断地修复由药物造成的碱基错配、片段插入/缺失，以保证DNA复制的忠实性来对抗药物对细胞的损伤杀灭作用。hmsh2基因在卵巢癌不同的组织学类型之间的表达差异，则表明低分化癌之所以预后较差，其原因之一可能是该类肿瘤易发生化疗耐药。

    尽管hmsh2的异常表达可能与卵巢癌的紫杉醇化疗具有相关性，但2p22上除了hmsh2基因与耐药相关外，尚存在许多候选基因，如：黄嘌呤脱氢酶基因（XDH）,钙调节蛋白2基因（CALM?2）可能也和耐药有关，因此hmsh2基因与紫杉醇耐药之间的关系及其确切机制有待进一步研究。

【】
  ［1］ 李红霞,刘冠媛,周友珍,等.卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/ PIX3 及OC3/ PIX5的建立及其生物学特性[J].中华医学研究杂志，2004,2(3):1?5.

［2］Leach FS,Hsieh JT,Molberg K,et al.Expression of the human mismatch repair gene hmsh2:a potential marker for urothelial malignancy［J］.Cancer,2000，88(10):2333?2341.

［3］Dabholkar M,Thornton K,Vionnet J,et al.Increased mRNA levels of xeroderma pigmentosum complementation group B (XPB) and Cockayne's syndrome complementation group B (CSB) without increased mRNA levels of multidrug?resistance gene (MDR1) or metallothionein?II (MT?II) in platinum?resistant human ovarian cancer tissues［J］.Biochem Pharmacol，2000,60:1611?1619.

［4］Takano M,Kudo K,Goto T,et al.Analysis by comparative genomic hybridization of genes relating with cisplatin?resistance in ovarian cancer［J］.Hum Cell,2001，14(4):267?271.

［5］Sonoda G,Palazzo J,du Manoir S,et al.Comparative Genomic Hybridization Detects Frequent Overrepresentation of Chromosomal Material From 3q26,8q24,and20q13 in Human Ovarian Carcinomas［J］.Genes Chromosomes Cancer,1997,20(4):320?328.

［6］姜润德，胡亮，关新元,等.人鼻咽癌顺铂耐药细胞系（CNE2/DDP）及其亲代细胞(CNE2)的比较基因组杂交研究［J］.癌症,2004,23（4）:386?390.

［7］Jacob S,Aguado M,Fallik D,et al.The role of the DNA mismatch repair system in the cytotoxicity of the topoisomerase inhibitors camptothecin and etoposide to human colorectal cancer cells［J］.Cancer Res,2001,61(17):6555?6562.

［8］Marcelis CL,van der Putten HW,Tops C,et al.Chemotherapy resistant ovarian cancer in carriers of an hMSH2 mutation?［J］. Fam Cancer,2001,1（2）:107?109.