表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用

【摘要】  目的 探讨选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用。方法 以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌Hela细胞为研究对象，利用MTT法检测ZD1839单药使用以及与顺铂联用分别对Siha和Hela细胞的增殖抑制作用。采用Burgi法分析联合用药的效果，并用流式细胞仪检测Siha和Hela细胞的细胞周期分布及凋亡率改变。结果 单独使用ZD1839能够抑制Siha、Hela细胞的增殖，其IC50值分别是1.48μmol/L、2.67μmol/L，而且抑制作用呈剂量依赖性。ZD1839能增强顺铂对Siha、Hela细胞的抑制作用，Burgi修正公式所得Q值分别为1.06±0.03（Siha）、1.13±0.01（Hela）。ZD1839使G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加。结论 ZD1839能够抑制宫颈癌细胞的增殖，并且能够增强顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用，该抑制作用可能与其使肿瘤细胞停滞于G1期和诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

【关键词】  宫颈癌；ZD1839；细胞增殖；细胞周期；凋亡

    宫颈癌发病率占女性生殖器官恶性肿瘤的首位。目前，放射是其主要治疗方法，但疗效并不令人满意。为进一步提高其疗效，人们研究包括顺铂等化疗药物在内的综合治疗手段，虽然取得了一定的疗效，但严重的毒副作用限制了其应用。ZD1839是一种新开发的可供口服的选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，已被美国FDA批准用于晚期非小细胞肺癌的治疗。由于宫颈癌细胞存在表皮生长因子受体的高表达，阳性表达率达90%以上［1］。我们推测针对表皮生长因子受体靶点的特异性抑制剂ZD1839，可能对其会有一定的治疗效果，因此，我们以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌Hela细胞为研究对象，通过体外研究试图探讨ZD1839对宫颈癌细胞的作用及其可能机制。

    1  材料与方法

    1.1  药物及试剂

    ZD1839由英国阿斯利康（Astra?Zeneca）公司提供，顺铂、四甲基偶氮哇蓝(MTT)、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，RPMI?1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自浙江民海公司。

    1.2  细胞及培养

    宫颈癌Siha、Hela细胞株为同济肿瘤科实验室冻存；细胞培养在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI?1640的培养液中，放置于37℃ 5%CO2的温箱中培养。

    1.3  MTT实验

    取对数生长期细胞制成1.5×104/ml细胞悬液，接种96孔板，每孔200μl（即3×103个细胞/孔）。置于培养箱中培养。待细胞贴壁2h后，吸弃旧培养液，加入各受试物继续培养24h后，每孔加MTT液20μl(5mg/μl)，继续孵育4h，吸弃每孔培养液，加入150μl DMSO，用酶联仪以波长570nm测定各孔A值。实验设药物处理组、细胞对照组和空白对照组，每组均设3个复孔。药物处理组在铺孔10h后加入含不同浓度药物的20μl培养液；细胞对照组加入200μl培养液;空白对照组在铺孔时不加细胞悬液，只加200μl培养液。在单药对Siha、Hela增殖抑制作用的实验中，药物处理组加入ZD1839的终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50和100μmol/L。在ZD1839与顺铂联用对Hela、Siha细胞抑制作用的实验中，分别检测了0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L和10μmol/ L的ZD1839与0.5、1、2、5和10μg/ml的顺铂联用对Hela、Siha细胞的抑制作用。实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为实验结果。按下列公式肿瘤细胞增殖抑制率：

    肿瘤细胞增殖抑制率（%）＝

    （1－药物处理组A值-空白对照组A值细胞对照组A值-空白对照组A值）×100%

    1.4  Borgi法分析联合用药效果

    根据细胞增殖实验测得ZD1839和顺铂的IC50值，各取ZD1839和顺铂的IC50值的半量单药或两药联合作用于Siha、Hela细胞，利用MTT法测得抑制率，并按下列公式计算Q值，判断两种药物联合作用的效应。

    Q＝平均E（A/2+B/2）平均EA/2+平均EB/2

    平均EA/2为1/2 IC50值的ZD1839组抑制率，平均EB/2为1/2 IC50值的顺铂组抑制率，平均E(A/2十B/2)为各取ZD1839和顺铂IC50值的半量两药联合作用的抑制率。Q>1为增强，Q=1为相加，Q<1为拮抗。上述实验重复3次，取平均Q值为实验结果。

    1.5  流式细胞术分析细胞周期分布及细胞凋亡情况

    取药物处理组及对照组细胞各约1×106个，用PBS缓冲液洗2次后，以-20℃预冷的80%乙醇溶液于4℃冰箱中固定过夜。将固定好的细胞1 000r/min离心5 min，弃去上清液，PBS缓冲液漂洗两次，将细胞悬液移至样品试管中，每管各加1%RNA酶100μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶100μl，使终浓度为50μg/ml，染色5 min，4℃避光30min后，在FACsort型流式细胞仪（美国BD公司产）上用488 nm激发光激发检测细胞的周期分布及凋亡情况。药物处理组分别加入0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L的ZD1839。实验重复3次取3次实验结果的平均值作为实验结果。

    1.6  数据处理  计量数据以均数±标准差表示，显著性检验采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  ZD1839单药对Siha、Hela细胞增殖的抑制作用

    ZD1839对Siha、Hela细胞的增殖均有明显的抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性，其抑制Siha、Hela细胞增殖的IC50值分别是1.48μmol/L、2.67μmol/L。

    2.2  ZD1839与顺铂联用对Siha、Hela细胞的作用

    ZD1839能增加顺铂对Siha、Hela细胞的增殖抑制作用, 单用顺铂（Siha：0.54mg/L、Hela：0.73mg/L）组抑制率（%）分别为29.3±0.2、27.2±0.3；顺铂（Siha：0.54mg/L、Hela：0.73mg/L）＋ZD1839（Siha：0.74μmol/L、Hela：1.34μmol/L）组抑制率分别为53.1±0.3、51.3±0.7。进一步用Borgi法分析两药的联用效果，按公式计算出Q值为1.06±0.03（Siha），1.13±0.01（Hela），说明ZD1839联合顺铂能增强抑制Siha、Hela细胞生长的作用，两者联合作用具有协同效应。

    2.3  ZD1839对Siha和Hela细胞周期分布的影响

    用流式细胞仪检测不同浓度的ZD1839作用后的Siha、Hela细胞的细胞周期分布情况。结果ZD1839能够使Siha、Hela细胞停滞于G1期，见表1、图1。

    2.4  ZD1839对Siha和Hela细胞凋亡的影响

    流式细胞术检测不同浓度的ZD1839诱导Si?表1  ZD1839对宫颈癌Siha和Hela细胞的细胞周期分布的影响

    3  讨论

    表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一个相对分子质量为170×103的跨膜糖蛋白受体，所编码的蛋白质属于I型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，分布在血管和表皮细胞膜上，它包括膜外区、跨膜区、膜内区3个部分［1?3］。当配体和受体膜外部分结合后，形成结合位点激活EGFR,其作用是把增殖和生存信号传导到受体的下游信号传导途径中［4, 5］。EGFR是原癌基因c?erB?1（HER?1）的表达产物，在多种肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等［1］中都有过度表达，当其活化后可以促肿瘤细胞粘附、浸润、增殖和肿瘤血管的生成［6］。由于EGFR在肿瘤细胞中的生物学活性，它已经成为新的抗肿瘤的靶点。目前，阻断表皮生长因子受体功能的策略有两种：一种策略为针对EGFR胞外配体结合区的单克隆抗体，通过单克隆抗体识别受体的胞外区，竞争性地与配体结合，干扰EGFR的自身磷酸化及阻碍细胞表面EGFR二聚体形成，抑制信号转导系统激活，从而抑制肿瘤细胞增殖，代表药物如IMC?C225等；另一策略为，用小分子化合物竞争结合EGFR酪氨酸激酶催化区的Mg?ATP结合位点，抑制酪氨酸激酶活性，阻断激酶及其底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶的信号转导通路，从而达到抗肿瘤目的，其中的代表药物是ZD1839（商品名为Iressa）。

    ZD1839是一种选择性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可以通过阻断信号传导途径而抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管生成，相关研究已经证实ZD1839对多种肿瘤均有抗肿瘤活性，而且不论是间断给药还是持续给药，都具有很好的耐受性［7］。在体外试验中，ZD1839对一系列肿瘤细胞株，如口腔癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌细胞等显示出明显的抑制作用［8］，体内试验也证实其能抑制前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等肿瘤的生长［9，10］，随后进行的临床研究表明其对非小细胞肺癌有着较好的治疗效果［7，11，12］，美国食品与药物管理局（FDA）也已批准ZD1839用于治疗晚期非小细胞肺癌。

    宫颈癌的表皮生长因子阳性表达率很高，可达90%以上［13］, 因此推测针对表皮生长因子受体靶点的特异性抑制剂可能会有一定的治疗效果。

    我们用MTT法检测ZD1839对宫颈癌Siha、Hela细胞的生长抑制作用。研究结果显示单独使用ZD1839对宫颈鳞癌细胞株Siha和腺癌Hela细胞株的增殖有明显的抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性。我们研究发现，ZD1839抑制Siha、Hela细胞增殖的IC50值分别是1.48μmol/L、2.67μmol/L，与Ranson［8］报道的ZD1839抑制其他类型肿瘤细胞系的IC50值范围一致。

    ZD1839与多种细胞毒药物化疗联合应用也具有协同抗肿瘤活性。意大利一个研究组对表达EGFR的人类卵巢癌（OVCAR?3）、乳腺癌（ZR?75?1，MCF?10A ras）和结肠癌（GEO）细胞系给予ZD1839联合细胞毒药物（顺铂、卡铂、草酸铂、紫杉醇、多西紫杉醇、表阿霉素、依托泊甙、拓扑替康和raltitrexed）进行观察，发现ZD1839联合上述任何一种化疗药物均有协同抑制肿瘤细胞生长的作用，其中铂类药物（CBP和DDP）和ZD1839合用可增强非小细胞肺癌A549生长抑制能力达3～5倍［14］。Al?Hazzaa A等［15］也研究发现将ZD1839与顺铂联合应用治疗头颈部癌（SCC?15）证实ZD1839能明显提高顺铂的抗肿瘤作用。顺铂是宫颈癌治疗中最常用的化疗药物，我们的结果表明，ZD1839能明显增强顺铂对Siha和Hela细胞的抑制作用。用Burgi法的联合用药Q值分别为1.06±0.03、1.13±0.01。

    Hopfner M等［16］报道ZD1839可诱导肝癌细胞株细胞周期停滞并可促进细胞凋亡。在我们的实验研究中，流式细胞仪分析显示，ZD1839也可诱导宫颈癌Siha、Hela细胞停滞于G1期，当ZD1839浓度为10μmol/L时G1期的比值分别从对照组的45.08%、45.58%上升到67.22%、72.87%（P<0.05）。随着ZD1839浓度的增加Siha、Hela细胞凋亡比率有逐渐增加的趋势，这表明ZD1839对Siha、Hela细胞抗肿瘤细胞增殖可能主要是通过促凋亡和诱导细胞周期阻滞而起作用。

    总之，由于EGFR在多种类型的实体瘤中呈现高表达，且与对治疗的低反应率、低生存率和疾病进展密切相关，实验研究显示通过多种途径作用于EGFR的信号转导通路，可以抑制肿瘤细胞增殖、减少肿瘤血管生成和肿瘤细胞转移，以及增加肿瘤细胞的凋亡率。我们的体外实验也证实了ZD1839单药以及联合传统的细胞毒性药物均对宫颈癌细胞具有明显的抗增殖和促凋亡作用。以上提示其可能具有诱人的临床应用前景，但EGFR靶向治疗中还存在着一些问题有待解决，如抗体的异质性，以及突变引起的耐药性，单药临床有效率低（仅15%左右［17］）等，ZD1839对宫颈癌细胞的影响和作用机制以及今后的临床应用值得进一步深入探讨。

【】
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