比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性CTL对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用

            作者：张希国，师建国，刘彦仿，阎庆国  

【摘要】  目的 研究人外周血不同来源的树突状细胞（dendritic cells，DC）光镜形态学、细胞超微结构及体内外诱导抗肿瘤免疫反应的差异。方法 联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)、白介素?4（IL?4）及肿瘤坏死因子（TNFα）从人外周血中培养出两类DC；人肝癌细胞系SMMC?7721细胞的可溶性肿瘤抗原刺激两类DC；两类DC激活同源的T淋巴细胞；观察两类DC激活的T淋巴细胞分别抑制已接种于裸鼠的人肝癌细胞系SMMC?7721移植瘤生长。结果 细胞因子诱导的人外周血DC群可见到两类DC亚群：一类可能来自DC前体细胞，另一类是由单核细胞分化来的DC；两类DC体外激活的T淋巴细胞能分别抑制肝癌细胞系SMMC?7721裸鼠移植瘤生长。结论 细胞因子诱导的人外周血DC群存在多相性，两类DC亚群体内外诱导的抗肿瘤细胞免疫反应不仅能抑制肝癌细胞系SMMC?7721裸鼠移植瘤发生，而且抑瘤率不同，提示两类DC亚群在肝癌的中发挥着不同的作用。

【关键词】  树突状细胞；肝癌；肿瘤免疫；裸鼠

    Anti?hepatocarcinoma Therapeutical Effect of Tumor Special CTL Activated by Two Kind of Dendritic Cells in Nude Mice

     Key words：Dendritic cells；Hepatocellular carcinoma；Tumor immunity；Anti?tumor vaccine

    树突细胞(dendritic cells, DC) 是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，可以在体内外向T淋巴细胞提呈抗原，并诱发CTL(细胞毒T淋巴细胞)反应。选择人外周血体外培养富集DC是研究DC的重要途径，但所面临的困难是DC在外周血中含量极微，而且DC的多源性和多功能性尚待进一步阐明。本实验我们借助于细胞因子诱导体外培养富集人外周血含量达70%～80% DC群，经形态学鉴定为两种DC群。体外分别诱导出针对肝癌细胞抗原的特异性，并用于荷瘤裸鼠的治疗以观察其抑瘤率的效果。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    重组人粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子（rhGM?CSF），重组人白细胞介素?4（rhIL?4）、CD86(Sigma公司），重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）（校肿瘤研究所馈赠），淋巴细胞分离液（上海华精生物科技有限公司），RPMI?1640、新生小牛血清（杭州四季青公司），MTT（华美生物工程公司），5周龄雌性BALB/c裸鼠[院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在校实验动物中心（SPF级动物实验室）完成]，健康人外周血（附属输血科）。

    1.2  方法

    1.2.1  DC的体外培养及收集  据略作修改[1]，人外周血单个核细胞（PBMNC）以合适的密度接种于培养瓶内，适宜条件培养2h后收集未贴壁细胞（97%以上T淋巴细胞，收集另培养），继续培养24h后按3×106 细胞/10ml 培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为A组，仍然贴壁的细胞作为B组，A组及B组细胞均在含终浓度为500u/ml的rhGM?CSF（1 000u/ml）及rhIL?4（500u/ ml）的上述RPMI?1640完全培养液中培养，A组及B组均于培养第3d向培养瓶中添加rhTNFα（终浓度500u/ml），每天半量换液，每隔3d全量换液（含上述3种细胞因子的培养液），于培养第9d收集DC群。

    1.2.2  两类DC亚群的透射电镜观察细胞超微结构  于培养第12天收集足量A、B两组DC群,经PBS液洗2次后低速离心获细胞沉淀，经固定、脱水、包埋、超薄切片复染后，透射电镜观察并照相。

    1.2.3  两类DC亚群活化的T淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤  分别收集活化后的淋巴细胞，按每孔5×105、2.5×105、5×104做效应细胞，靶细胞分别为SMMC?7721细胞、hepG2细胞。靶细胞浓度为每孔5×105。同时做效应细胞和每种靶细胞的对照各3复孔。效应细胞与靶细胞混合培养16h后加入5mg/ml MTT10μl继续培养8h。离心培养板（2 000r/min，10min），弃去上清液，每孔加DMSO100μl，于570nm处测定A值各自实验结果。

    1.2.4  荷瘤裸鼠模型的建立  收集对数生长期的SMMC?7721细胞，接种于裸鼠背部皮下，2×106/只，抑瘤率由治疗初始肿瘤重量?治疗结束时肿瘤重量/治疗初始肿瘤重量来表示。

    1.2.5  两类DC亚群诱导的肿瘤抗原特异性CTL治疗荷瘤裸鼠模型  15只裸鼠中全部长出肿瘤。随机挑选5只荷瘤鼠为A群DC活化的肿瘤特异性CTL1治疗组，另选5只作为B群DC活化的肿瘤特异性CTL2治疗组，最后5只为阴性对照组。

    1.2.6  统计学方法  实验结果采用SPSS统计软件进行方差分析。

    2  结果

    2.1  人外周血来源的两类DC亚群的形态特征观测  在倒置显微镜下观察，A、B两组培养第3～4d时可见大部分细胞呈梭形，细胞表面呈毛刺状，细胞大小约为单核细胞的1～1.5倍， A、B两组细胞在数量及形态上无显著差异。

    2.2  两类DC亚群细胞超微结构  将体外培养第12d的A、B组DC群样本在透射电镜下观察，从亚细胞器的超微结构特征来看，DC群含两类DC：一类DC亚群在A组多见，其细胞表面有大量树枝状突起，细胞核形状不规则，核内异染色质沿核边高度凝聚，胞质中线粒体相当丰富，溶酶体、粗面内质网、胞饮小体数量少或无，见图1a、b，这类DC中个别细胞表面树突粗大者，其胞浆内核糖体及光面内质网清晰可见，部分内质网扩张或有些线粒体膨胀，见图1c，提示这些细胞活动度大、供能旺盛，我们分析这类DC可能源自DC前体细胞;另一类DC群在B组皆是，其细胞结构特征为细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，有大量皱褶及粗大树枝结节状突起，细胞核常呈肾形或马蹄形，核内异染色质边集， 胞浆内线粒体比第1类DC群相对少，高尔基体及板层溶酶体较多，见图2a、b、c，我们分析这些可能是由单核细胞分化来的DC的超微结构特征。表1  两类DC亚群活化的CTL对SMMC?7721表2  两类DC诱导的CTL对SMMC?7721移植廇抑瘤率的影响

    2.3  两类DC亚群活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤  负载肝癌SMMC?7721细胞可溶性抗原后两类DC亚群活化的T细胞，对SMMC?7721细胞、hepG2细胞均有不同程度的杀伤作用，见表1，杀伤效果明显高于非特异性淋巴细胞对照组且由B群DC活化的CTL2组的杀伤效果高于由A群DC活化的CTL1治疗组的杀伤效果。

    2.4  肝癌荷瘤鼠模型的建立  在接种后的7天内15只裸鼠全部长出肿瘤，荷瘤鼠平均重量变化及肿瘤平均重量，见表2。

    2.5  两类DC亚群诱导的肿瘤抗原特异性CTL1、CTL2对荷瘤裸鼠模型的治疗作用观察  以被激活的CTL治疗裸鼠已生长出的SMMC?7721移植瘤，接种后的第35天对照组、A群DC诱导的CTL1治疗组及B群DC诱导的CTL2治疗组裸鼠的体重变化、移植瘤的重量变化、及抑瘤率，见表1。其生长曲线，见图3。结果显示与对照组相比，CTL1治疗组及CTL2治疗组移植瘤生长均受到不同程度抑制（P＜0.05，P＜0.01）。在两治疗组中，CTL2治疗组移植瘤生长受到抑制更明显（P＜0.05）。

    3  讨论

    鉴于DC是免疫系统中一类最重要的抗原提呈细胞（APC），在启动T细胞免疫应答和T细胞依赖性应答中起关键作用，近年来对DC的临床研究愈来愈令人瞩目[2?4]。

    我们观察到人外周血PBMNC经移弃大部分T细胞后，再于RPMI?1640完全培养液中继续培养24h获取贴壁单核细胞CD14+ ，经细胞因子联合刺激培养获取的DC群变为CD14?并诱导分化为两类DC亚群，借助于透射电镜观察到，从A、B 两组人外周血富集的DC群（尤其是B组DC群）中相当一部分DC的胞膜和胞浆近膜侧有许多清晰可见的溶酶体，显示DC具有饱饮活性，这可能提示B组DC群抗肿瘤的能力更强。单核?巨噬细胞和DC具有高度的派生、表型、功能和分子可塑性，它们源自骨髓中共同的多能造血祖细胞[5]。有报道，由CD34+细胞分化而来的DC（CD34+ progenitor cell?derived DC，PC?DC)和由单核细胞衍生来的DC(monocyte?derived DC，Mo?DC) 的功能性质所有不同， PC?DC可能比Mo?DC 更适合用于肿瘤的免疫治疗[6]。

    两类DC亚群，经SMMC?7721细胞的可溶性抗原刺激后在体外诱导自体T淋巴细胞分别产生CTL，两类DC亚群诱导的CTL对SMMC?7721细胞与hepG2细胞杀伤率差异性说明两类DC亚群诱导的CTL存在差异性和较高的特异性，进一步在荷瘤裸鼠模型进行治疗性研究发现，B组DC群诱导的CTL具有显著的抑瘤效应，与A组DC群治疗组诱导的CTL及对照组相比，差异具有显著性。体内实验产生抗肿瘤效应结果与体外实验的结果一致。

    本研究结果为我们进一步从人外周血分离富集DC，采用抗原特异性DCs激发肿瘤抗原特异性自体T细胞并输注给肿瘤患者的过继免疫疗法提供了新思路，值得进一步研究[7，8]。

【文献】
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［3］ Tang ZH, Qiu WH, Wu GS, et al. The immunotherapeutic effect of dendritic cells vaccine modified with interleukin?18 gene and tumor cell lysate on mice with pancreatic carcinoma ［J］. World J Gastroenterol, 2002, 8(5): 908?912.

［4］ Terasawa H, Tsang KY. Identification and characterization of a human agonist cytotoxic T?lymphocyte epitope of human prostate?specific antigen ［J］. Clin Cancer Res, 2002, 8(1): 41?53.

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［6］ Van Tendeloo VF, Snoeck HW, Lardon F, et al. Nonviral transfection of distinct types of human dendritic cells: high?efficiency gene transfer by electroporation into hematopoietic progenitor?but not monocyte?derived dendritic cells［J］. Gene Ther，1998, 5(2): 700?707.

［7］ Dallal R，Lotze M．The dendritic cell and human cancer vaccines［J］．Cuin Opin Immunol，2000，12(3)：583?588．

［8］Nouri Shiazi M，Banchereau J，Fay J，et a1．Dendritic ce11 based tumor vaccines［J］．Immunology Letters，2000，74(4)：5?10．