肿瘤停滞因子的功能与结构

          作者：石小莉，朱丽丽，张立梅，袁彩，陈锦灿，黄明

【关键词】  肿瘤停滞因子；基质金属蛋白酶MMP?9；αvβ3整合蛋白

 基金项目：院"百人计划"基金；福建物质结构研究所结构化学国家重点实验室资助项目(IB021061)
    美国哈佛医学院的Folkman医师1972年首先提出肿瘤的生长和转移与血管的新生有关［1,2］，这观点随后得到了大量的基础研究和临床实验的证明［3］。迄今为止，在体内已发现了多种血管生成的促进和抑制因子，如vascular endothelial growth factor(VEGF)、angiostatin、endostatin、thrombospondin?1、canstatin和tumstatin等［4?7］。其中，很多血管生成抑制因子能通过作用于增殖和转移的内皮细胞来抑制肿瘤生长。Tumstatin（肿瘤停滞因子）就是其中一种,而且与其他的血管生成抑制因子不同的是它能选择性地作用于肿瘤血管的内皮细胞，而不影响到正常的内皮细胞。本文报道了肿瘤停滞因子的功能及其结构研究的结果。

    1肿瘤停滞因子与血管基底膜之间的关系

    在血管新生的过程中，内皮细胞必须依附于血管基底膜（vascular basement membrane）才能形成血管。血管基底膜是特化的细胞外基质，它不仅对内皮细胞提供了机械的支持，而且也影响细胞的生物学行为，如分化、增殖和迁移等［8］。对基膜的组成进行研究发现，IV型胶原蛋白是组成血管基底膜的主要大分子物质，IV型胶原蛋白有6种不同的基因产物（即α1～α6），三条α链聚合而成一个三螺旋体。α1、α2链存在于人体内所有组织的基底膜中，而其他4种α链则分布于不同的组织基底膜。每条α链可分为三个不同的结构域：N末端的富含半胱氨酸7S结构域、中间三螺旋体结构域和C末端的球形非胶原结构域1(NC1)［9］。 IV型胶原蛋白通过其NC1结构域聚合成三聚体形成结构构成基膜的支架。其中α3链的NC1区即为肿瘤停滞因子［6］。

    2肿瘤停滞因子在体内、体外的生物活性

    肿瘤停滞因子全长232个氨基酸，在多种体内和体外实验中研究发现其具有两个功能相互独立的活性区域，即N端54～132氨基酸多肽片断和C端185～203氨基酸多肽片断。前者具有抗血管生成活性，后者则具有抗肿瘤增生和入侵活性。这就凸显了肿瘤停滞因子在众多抗肿瘤药物中的特殊地位，使得其成为有潜力的药物蛋白，也因此引起了人们的广泛关注。

    90年代初科学家用体外合成的肿瘤停滞因子C端185～203氨基酸片断作用于多形核白细胞，结果表明此活性片断具有体外抗肿瘤活性［１０］。为了了解肿瘤停滞因子在体内的作用，Kalluri及他的同事［１１］分别将三种不同类型的肿瘤植入野生型或肿瘤停滞因子缺陷型小鼠中。实验结果表明：当肿瘤体积小于500mm3时，缺陷型小鼠和野生型小鼠中的肿瘤以相同的速率生长；当体内的肿瘤体积大于500mm3后，缺陷型小鼠中的肿瘤生长速度大大加快，数天后肿瘤体积也比野生型的大了两倍多。这种影响是可逆的。肿瘤停滞因子在正常小鼠体内循环系统中的生理浓度大约是336±28 ng/ml。如果每天向体内肿瘤细胞体积已经达到500mm3的缺陷型小鼠注射300ng重组肿瘤停滞因子就会把肿瘤生长速率降低到野生型的水平。这些结果说明了肿瘤停滞因子是强有力的肿瘤抑制分子   ［７?１２］。进一步研究发现肿瘤停滞因子C端185～191(CNYYSNS)七肽序列中的188～191四个氨基酸(?YSNS?)在空间形成β转角，是抗肿瘤生物活性的核心部分，也是与αvβ3整合蛋白相互作用的关键位置［１３］ 。

    3肿瘤停滞因子功能的调控机制

    为了研究肿瘤停滞因子抗血管生成活性，Maeshima等在体外分别克隆了8个具有相互重叠氨基酸序列的多肽片断并结合基因敲除的方法对它们进行研究，发现54～132氨基酸片断是它的生物活性核心部位。随后这个研究小组继续对54～132氨基酸片断研究发现74～98这25个氨基酸具有与全长的肿瘤停滞因子相等的抗血管生成活性。这一结果也在小鼠的前列腺癌PC?3模型和肾透明细胞癌786?O模型中得到了验证。作为一种有效的抗血管新生的内源性因子，肿瘤停滞因子的生物活性主要取决于两个因素：基质金属蛋白酶MMP?9和αvβ3整合蛋白。前者主要负责降解血管基底膜以生成肿瘤停滞因子，后者则是肿瘤停滞因子的受体蛋白。

    MMP?9是怎样降解基膜胶原蛋白产生肿瘤停滞因子的？在肿瘤入侵机体的过程中，肿瘤细胞和基膜之间的相互作用启动了一系列的基底膜组分的蛋白水解反应。这个降解过程是由包括基质金属蛋白酶（MMPs）和血浆酶原等蛋白酶所介导的。MMPs是一个包含至少25个成员的大家族。MMP?9主要由免疫细胞、基质细胞和肿瘤细胞产生，MMP?9（以及MMP?2、MMP?3、和MMP?13）已经被证明对降解基膜胶原蛋白发挥了重要的作用。研究发现，MMP?9缺陷型小鼠体内具有较低的肿瘤停滞因子浓度［大约（141±21）ng/ml］，其肿瘤的体积和肿瘤的生长速度都比野生型小鼠的快，在每天向这些缺陷型小鼠体内注射200ng的重组人肿瘤停滞因子，14天后缺陷型小鼠肿瘤生长速率就会降低到野生型一样的速率［11］， 表明了MMP?9是产生肿瘤停滞因子的一个必要因素。然而，需要指出的是，实验发现小鼠肿瘤生长未达到500mm3时，MMP?9缺陷型小鼠的肿瘤生长速度和肿瘤体积与野生型小鼠相近，表明MMP?9在基底膜降解的不同阶段具有截然不同的作用。在基底膜降解的初期，MMP?9能介导血管内皮生长因子（VEGF)的释放，从而促进了肿瘤周围的血管新生，而在中后期则降解基膜中的胶原蛋白，生成肿瘤停滞因子，从而抑制肿瘤了的生长和转移［14］。

    αvβ3整合蛋白是肿瘤停滞因子特异性地抑制肿瘤血管生成的一个必要因素。肿瘤停滞因子不能抑制αvβ3整合蛋白缺陷型小鼠体内肿瘤相关的病变血管形成［１１ ］，说明了肿瘤停滞因子在体内的作用需要αvβ3整合蛋白。分子水平［１５］的研究表明αvβ3整合蛋白与肿瘤停滞因子有直接的相互作用，是肿瘤停滞因子在细胞表面的受体。在肿瘤停滞因子缺陷型小鼠中，肿瘤细胞的生长必须达到500mm3体积后，才表现出快速增长的现象。Kalluri等对100mm3～500mm3不同体积的肿瘤表面表达的β1和β3整合蛋白的表达进行评估，发现了体积为100mm3的肿瘤中80％的肿瘤表面有β1蛋白表达，同时只有8%的表达β3整合蛋白；当肿瘤继续生长到500mm3时，40％的肿瘤血管表达出β3整合蛋白，接着就一直保持在这个水平，该结果也说明了肿瘤停滞因子是通过αvβ3整合蛋白发挥其生物学作用的。

    有趣的是，小鼠在自身肿瘤停滞因子缺乏时,并不影响受孕、发育和伤口修复等正常血管新生的生理过程，但新生病变血管的生成和肿瘤生长却加速了，最终导致缺陷型小鼠死亡［１６］。 研究发现增殖期的肿瘤细胞血管表面有40％的αvβ3整合蛋白，但是在修复皮肤伤口或再生的肝部的血管表面并没有发现此整合蛋白，从分子水平上阐明了肿瘤停滞因子作为肿瘤相关的病变血管生成抑制剂的分子基础。

    唐氏综合征的病人由于第21号染色体多了一条，常有智力迟钝的现象，临床发现这类病人的肿瘤发病率较低。研究发现，他们体内的肿瘤停滞因子浓度高于常人［１７］，这进一步旁证了肿瘤停滞因子与肿瘤的密切关系。

    4肿瘤停滞因子的结构研究

    肿瘤停滞因子含有两个与αvβ3整合蛋白以RGD非依赖方式相互作用的片断：N端片断（氨基酸54～132）和C端片断（氨基酸185～203）。前者通过与αvβ3整合蛋白接合来抑制FAK激酶(focol adhesion kinase)、PI3激酶(phosphatidylinositol 3?kinase)和PKB/Akt激酶(protein kinase B)的活性途径，来抑制内皮细胞的增殖，诱导内皮细胞的细胞凋亡。而后者主要通过与αvβ3整合蛋白接合来抑制FAK和PI3激酶的活性途径来抑制细胞蛋白质合成和细胞增殖，从而达到抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞增生和转移的目的［１８］。

    人胎盘IV型胶原蛋白α1链NC1域的晶体结构［１９］已被测定，为肿瘤停滞因子的结构研究提供了基础。一级氨基酸序列分析发现肿瘤停滞因子和IV型胶原蛋白α1链NC1域的一级氨基酸序列具有71.9%的同源性，以后者的晶体结构为模板通过同源模建程序构建了肿瘤停滞因子的三维结构模型，见图1。模型显示单链肿瘤停滞因子由两个连续的、具有相似拓扑结构的亚域（subdomain I和subdomain II）组成，每一个亚域都具有9条β链（β1－β9）。β5和β6组成一个指状发卡环插入自身另一个亚域或邻近α链的亚域的β7和β8链之间，与β3和β4组成一个完整的6条链相互反平行的β片层结构。三个肿瘤停滞因子分子形成一个三聚体的帽状结构，两个三聚体通过蛋氨酸（Met?108）和赖氨酸(Lys?226)相互作用进一步构成一个六聚体结构。在每个帽状结构中，6个亚域的完整6条β片层结构环绕着中心轴层放射状排列，见图2。

    图1单链肿瘤停滞因子的同源模建空间结构模型。

    图2肿瘤停滞因子的帽状三聚体的同源模建结构模型

    目前对肿瘤停滞因子及它的抗血管生成的机制还有待深入研究。用实验手段测定肿瘤停滞因子及其与αvβ3整合蛋白复合物的三维结构将有助于进一步阐明其功能与结构的关系，为肿瘤的领域开辟新的契机。

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  ［1］ Folkman J.Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors[J].Ann Surg,1972,175 (3):409?416.

［2］ Folkman J.Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid and other disease［J］.Nat Med,1995,1 (1):27?31.

［3］Holash J,Wiegand SJ,Yancopolos GD.New model of tumor angioenesis : dynamic balance between vessel regrewssion and growth mediates by angiopoietins and VEGF［J］.Oncogene,1999,18 (5):356?362.

［4］O'Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma［J］.Cell,1994,79 (2):315?328.

［5］O'Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］.Cell,1997,88 (2):277?285.

［6］ Maeshima Y,Colorado PC,Torre A,et al.Distinct antitumor properties of a type IV collagen domain derived from basement membrane［J］.J Biol Chem,2000,275 (28):21340?21348.

［7］ Kamphaus GD,Colorado PC,Panka DJ,et al.Canstatin,a novel matrix-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］.J Biol Chem,2000,275 (2):1209?1215.

［8］ Paulsson M.Basement membrane proteins: structure,assembly,and cellular interactions［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol,1992,27 (1-2):93?127.

［9］ Egeblad M,Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer,2002,2 (3):161?174.

［10］Monboisse JC,Garnotel R,Bellon G,et al.The alpha 3 chain of type IV collagen prevents activation of human polymorphonuclear leukocytes［J］.J Biol Chem,1994,269 (41):25475?25482.

［11］Hamano Y,Zeisberg M,Sugimoto H,et al.Physiological levels of tumstatin,a fragment of collagen IV alpha3 chain,are generated by MMP-9 proteolysis and suppress angiogenesis via alphaV beta3 integrin［J］.Cancer Cell,2003,3 (6):589?601.

［12］Sund M,Hamano Y,Sugimoto H,et al.Function of endogenous inhibitors of angiogenesis as endothelium?specific tumor suppressors［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102 (8):2934?2939.

［13］Floquet N,Pasco S,Ramont L,et al.The antitumor properties of the alpha3(IV)?(185?203) peptide from the NC1 domain of type IV collagen (tumstatin) are conformation?dependent［J］.J Biol Chem,2004,279 (3):2091?2100.

［14］Kalluri R.Basement membranes: structure,assembly and role in tumour angiogenesis［J］.Nat Rev Cancer,2003,3 (6):422?433.

［15］Maeshima Y,Yerramalla UL,Dhanabal M,et al.Extracellular matrix?derived peptide binds to alpha(v)beta(3) integrin and inhibits angiogenesis［J］.J Biol Chem,2001,276 (34):31959?31968.

［16］Andrews KL,Mudd JL,Li C,et al.Quantitative trait loci influence renal disease progression in a mouse model of Alport syndrome［J］.Am J Pathol,2002,160 (2):721?730.

［17］Zorick TS,Mustacchi Z,Bando SY,et al.High serum endostatin levels in Down syndrome: implications for improved treatment and prevention of solid tumours［J］.Eur J Hum Genet,2001,9 (11):811?814.

［18］Hamano Y,Kalluri R.Tumstatin,the NC1 domain of alpha3 chain of type IV collagen,is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth［J］.Biochem Biophys Res Commun,2005,333 (2):292?298.

［19］Than ME,Henrich S,Huber R,et al.The 1.9?A crystal structure of the noncollagenous (NC1) domain of human placenta collagen IV shows stabilization via a novel type of covalent Met?Lys cross?link［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99 (10):6607?6612.