BAG?1在喉鳞癌组织中表达及其与p53基因和细胞凋亡的相关性

                 作者：吴曙辉, 江孝清, 周绪红, 尹述成

【摘要】  目的 最近研究发现在恶性肿瘤细胞中存在BAG?1蛋白表达水平和活性异常升高。本研究探讨在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell caicinomas, LSCC)中BAG?1表达临床意义及其与p53、细胞凋亡的关系,以了解BAG?1与喉癌发生及预后的关系。方法 运用免疫组化技术及TUNEL法检测68例LSCC组织及30例癌旁组织中BAG?1、p53蛋白的表达及癌细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)，并应用机图像分析系统对其阳性表达进行定量分析。结果 BAG?1在LSCC及癌旁组织中的阳性率分别为76.5%、16.7%, BAG?1蛋白在LSCC组织的表达较癌旁组织中的表达高(Ｐ<0.05)，5年生存者BAG?1蛋白表达阳性率显著低于5年死亡者（Ｐ<0.05），且细胞核BAG?1阳性者较细胞浆阳性者预后更差(Ｐ<0.05)；BAG?1蛋白阳性组及BAG?1蛋白阴性组的p53蛋白阳性率差异无显著性(Ｐ>0.05);BAG?1阳性患者的AI均数显著低于阴性患者（Ｐ<0.01）, 且表达呈负相关(r=-0.602)。结论 BAG?1可能在LSCC的细胞凋亡及肿瘤发生中起着重要作用,并对LSCC的早期诊断，预后判断有着重要的意义。

【关键词】  喉肿瘤；鳞状细胞癌；预后；BAG?1；p53；免疫组化;凋亡

    Expression of BAG?1 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma and Its Relationship with p53 Gene and Cell Apoptosis

     Key words：Laryngeal neoplasms; Squamous cell carcinoma; Prognosis; BAG?1; p53; Immunohistochemistry; Apoptosis

    细胞凋亡(Apoptosis)是在特定环境条件下普遍存在的生理过程,许多研究结果显示细胞凋亡是由一些基因所调控,包括凋亡诱导剂(p53、bad、bax、bak、bcl?Xs和bik)和凋亡抑制剂(BAG?1、 bcl?2、bcl?Xl和mcl?2 )[1]。目前已经确定的是,细胞凋亡诱导剂p53在人类许多恶性肿瘤中检测到缺失或突变。相反地,BAG?1 (Bcl?2?associated athanogene?1)是一种细胞凋亡抑制剂,在许多不同类型的人类肿瘤组织中呈过度表达。然而,BAG?1在喉癌致癌机制中的作用,以及BAG?1表达与p53,细胞凋亡关系的研究，目前国内外尚罕见报道。在此我们检测喉鳞癌(laryngeal squamous cell caicinomas, LSCC)组织中BAG?1的表达情况,并观察它与p53,细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)的关系,以探讨 BAG?1在喉癌中的表达及其与p53,细胞凋亡的关系。

    1  资料与方法

    1.1  标本来源与临床资料

    选用武汉大学中南1995年1月～2000年12月期间经手术切除的喉鳞癌石蜡标本68例,对应喉癌旁组织标本30例。68例喉癌患者年龄37～78岁，中位年龄56岁。其中男性59例，女性9例。肿瘤病理分级:高分化(G1)27例,中分化(G2)17例,低分化(G3)24例。根据1997年UICC标准进行TNM临床分期:Ⅰ～Ⅱ期32例,Ⅲ～Ⅳ期36例。19例伴术前颈淋巴结转移,49例无转移。所有病例术前均未作放疗或化疗,随访时间39～74个月, 68例中生存期超过5年的有25例,5年以内38例,失访5例，失访者按死亡计。30例癌旁组织为术中所取标本,距癌灶10cm处取材，均避开溃疡及坏死区。所有标本均经病理检查证实,喉癌旁组织标本经病理检查确认无癌细胞。标本取材后一式两份, 一份置-70℃低温冰箱编号保存备用，一份送病检，经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片。

    1.2  免疫组织化学染色检测BAG?1、p53的蛋白表达

    采用链霉菌抗生物素蛋白?过氧化酶法(streptavidin peroxidme, SP), 二氨基联苯胺(diamionben zidene DAB)显色。BAG?1多克隆抗体购自武汉博士德公司，p53 单克隆抗体 (DO?1)购自美国Santa Cruz公司，SP超敏试剂盒购自福建迈新生物技术开发公司。操作步骤参照说明书进行，微波抗原修复。用已知阳性组织标本作阳性对照, 以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)代替第一抗体作为阴性对照,所有切片采用一批试剂完成。

    1.3  细胞凋亡

    采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TDT?mediated?DUTP nick end Labeling technique, TUNEL),操作步骤严格按说明书进行。标记液及抗体购自武汉博士德生物公司，每批染色均设有阳性和阴性对照。

    1.4  结果判定及计算机图像分析

    采用同济干屏影像工程公司HPIAS 2000型彩色多媒体图像分析软件。BAG?1细胞浆细胞核棕黄色染色为阳性。p53细胞核棕黄色染色为阳性,凋亡阳性细胞为细胞核棕黄色。在10×40倍光镜下，在标记良好区域选择3个视野，对其阳性细胞表达的阳性率进行定量分析,取阳性率的平均值为标本结果进行统计学分析。BAG?1阳性标准:阳性细胞占肿瘤细胞数<30%为低表达（＋），30%～50%为中度表达（＋＋），>50%为高表达（＋＋＋）。p53阳性标准：阳性细胞占肿瘤细胞数<10%为阴性，10%～25%为低度表达（＋），26%～50%为中度表达（＋＋），>50%为高表达（＋＋＋）。以平均每100个细胞中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(apoptosis index, AI), AI=总凋亡细胞数量/总肿瘤细胞数量×100%，以均数±标准差(±ｓ)的形式表示。

    1.5  统计学处理

    数据采用χ2检验, t检验, 经SPSS10.0统计软件包分析处理。P<0.05为有显著性差异。

    2  结果

    2.1  BAG?1在LSCC及癌旁组织中的表达

    BAG?1免疫组化阳性染色呈棕黄色颗粒，染色强弱不等,呈弥漫散在阳性,但大多数病例为不均匀表达，见图1～2。68例喉癌组织中,BAG?1阳性表达52例,而在30例喉癌旁组织中,BAG?1阳性表达5例，进一步统计分析表明在喉癌组织中BAG?1的阳性表达率高(76.5%),而喉癌旁组织BAG?1的阳性表达率低(16.7%),其差异有显著性（Ｐ<0.01）。

    BAG?1染色阳性分为细胞核表达、细胞浆表达或者二种同时表达三种形式，见图1～2。但是，这三种染色方式没有显示出明显的分界。在LSCC及癌旁组织中细胞核细胞浆表达的情况均存在，但是喉癌旁组织中仅有1例为细胞核BAG?1表达（3.3%），而在68例喉癌组织中细胞核BAG?1表达的有39例(57.4%)。统计学分析细胞核BAG?1表达在喉癌旁组织中与喉癌组织中相比，其差异有显著性（Ｐ<0.01）。

    2.2  LSCC组织中BAG?1蛋白的表达与临床病理参数的关系

    喉癌组织中BAG?1的阳性表达与肿瘤的组织学分化程度，TNM分期及是否颈淋巴结转移无关(Ｐ>0.05),术后生存期低于5年患者BAG?1阳性表达率（93.0%）显著高于生存期超过5年者（48.0%）(Ｐ<0.05)。

    2.3  LSCC组织中BAG?1蛋白表达与p53,细胞凋亡表达的关系

    p53阳性细胞呈棕黄色颗粒，主要定位于肿瘤细胞的细胞核内，呈颗粒状或网状，见图3。68例喉癌组织中p53阳性表达44例（64.7%），而在30例喉癌旁组织中均无表达，与前者相比较差异显著(Ｐ<0.05)。BAG?1阳性组，p53有33/52强阳性表达,BAG?1阴性组p53只有11/16强阳性表达,经χ2检验两者表达无显著性差异(Ｐ>0.05),相关性分析显示Pearson列联系数为-0.047,二者无显著性相关。

    TUNEL染色阳性信号细胞棕黄色,位于细胞核内,浓缩的核质紧贴核膜或核质呈均匀染色,可见凋亡小体(apoptotic bodies)散在分布，见图4。68例LSCC中AI为（14.87±3.94）, 30例癌旁组织中AI为（7.18±2.34）, 与前者相比较差异显著(Ｐ<0.01)。统计学表明,组织中BAG?1基因表达水平和细胞凋亡指数呈显著的负相关(r=-0.602)。表1  BAG?1蛋白表达与LSCC临床病理参数的关系

    3  讨论

    喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，随着的,喉癌发病率有逐年增高的趋势,而其发病机制尚未明了。近年来,凋亡障碍及其机制成为肿瘤学研究的一个热点。BAG?1（Bcl?2?associated athanogene?1）也称为HAP46或RAP46, 是一种具有抗凋亡能力的多功能结合蛋白,自从1995年被Takayama等发现以来，BAG?1已引起研究者的特别兴趣。

    BAG?1在大部分正常人体组织呈微弱表达或不表达,但在大多数肿瘤细胞系，如乳腺癌、肾癌、前列腺癌、和直肠癌等均有表达[3，4],表明其表达与肿瘤的恶性转化密切相关。BAG?1在各种肿瘤中的表达具有不同的意义。Rorke［5］发现BAG?1表达与非小细胞肺癌的预后有关，细胞质强阳性者预后较好。Yang等［1］发现在宫颈癌细胞系及其组织中BAG?1过表达。Shindoh[6]发现在鳞状细胞癌中转移的病例较未转移者表达高，高分化的较低分化的阳性表达高。本实验结果表明BAG?1在喉癌及其癌旁组织中均有表达，但在喉癌中表达较癌旁组织增强,且在癌旁组织中的表达主要呈弱阳性。喉癌组织中BAG?1的高表达，提示BAG?1可能参与了喉癌细胞凋亡与分化的调控。有意义的是生存期低于5年的BAG?1阳性表达率明显高于5年生存者,提示BAG?1表达可能是一种有效预测喉癌预后的分子标记。

    此外，BAG?1蛋白在喉癌细胞的胞核和胞浆都有阳性表达,大部分表达在胞核,小部分表达在细胞浆。这可能是由于BAG?1亚型的不同细胞定位而造成的。在喉癌旁组织即使发现BAG?1细胞浆和细胞核着色,也是有限的。而且我们的结果显示，喉癌中BAG?1阳性表达与5年生存率有关。由此，推测特异性核定位BAG?1是预测喉癌复发最重要的特征。但是，BAG?1的过度表达与它们的分级没有明显联系。大多数低分化癌（80%）显示出核BAG?1染色。BAG?1与喉鳞癌组织的分化程度无显著差异(Ｐ>0.05),表明BAG?1的表达只是喉癌发生的早期事件,可作为喉鳞癌组织发生癌变的早期诊断指标,也为喉癌的提供了新的思路。

    由于BAG?1基因发现的时间不长,关于BAG?1与头颈肿瘤方面的报道极少。研究表明BAG?1似乎与bcl?2联合作用抑制p53诱导的凋亡。抑癌基因p53定位于人类第17条染色体短臂(17p3),50%以上的人类肿瘤都检测到p53基因的缺失或突变。p53基因为细胞癌基因中研究最为广泛和深入的基因之一,长期以来,人们认为p53抑制肿瘤生长的机制是由于它阻断细胞周期的进行。但随着研究的深入,发现p53通过细胞周期停止和细胞凋亡的激活来抑制细胞生长，并且认为诱导凋亡的功能是它的肿瘤抑制活性的中心。有意思的是，在体外转染试验中，运用一种由BAG?1启动子分离的报道基因，发现p53突变提高了BAG?1启动子活性[4]。因此，p53突变可能是造成BAG?1过度表达的一种机制。另外在BAG?1表达降低的HELA细胞中p53表达升高。这暗示着反义BAG?1可能通过加强p53的功能而促进凋亡[7]。更为重要的是，以前已报道在突变型p53源性的肿瘤中BAG?1蛋白表达的上调,有人推测认为与p53基因突变失活有关。因此，表达有突变p53的细胞中，BAG?1的上调表达可能以一种反馈环路通过p53功能抑制凋亡[7]。但是，我们的数据没有显示出p53突变与BAG?1过度表达的相关性，暗示即使它参与BAG?1过度表达也是有限的。另外本组喉癌旁组织中p53表达均阴性，68例LSCC组织中p53的阳性表达为64.7%,表明p53表达与LSCC的生物学行为关系密切,可作为判断LSCC患者预后一项重要指标。

    BAG?1在最初克隆发现是一种与bcl?2结合的抗凋亡分子，为bcl?2家族成员之一，其后的研究表明它是一种多功能蛋白[8,9]。虽然bag?1不属于bcl?2家族成员，但是其启动子区与bcl?2具有高度同源性,可以与bcl?2形成复合物,并相互作用,从而促进抗细胞凋亡的能力[10]。BAG?1具有拮抗PDGF和HGF介导的凋亡作用，可与肝细胞生长因子受体结合形成复合物，诱导细胞凋亡后，此复合物迅速增加。除bcl?2以外,它还可与和一群不同性质的蛋白质相互作用,如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Raf?1、类固醇激素受体和酪氨酸激酶受体, BAG?1也像一种伴侣蛋白,可与组成性热休克蛋白70(73KDa heat shock cognates protein,HSC70)和诱导性热休克蛋白70(72KDa heat shock protein,HSP70)作用,发挥多种生理、病理功能[10]。但凋亡调控作用仍是其诸多功能中最为重要的。本试验采用TUNEL法检测喉癌细胞凋亡的情况,结果显示LSCC及癌旁组织中显示不同程度的细胞凋亡,它们之间表达差异有显著性(Ｐ<0.05)。表明细胞凋亡的异常可能在喉癌的发生发展过程中起重要作用。并且BAG?1阳性者AI显著低于阴性者,说明BAG?1在喉癌中的过度表达有抑制细胞凋亡的功能。

    总之, 肿瘤的发生与发展并非单一因素作用的结果,每一个环节都有可能有多基因和多因素共同参与。凋亡的调控是细胞生理死亡和肿瘤发生的重要机制。从本研究结果来看, 抑凋亡基因BAG?1可能作为早期诊断喉癌的一种生物标记，尤其是细胞核BAG?1定位可能作为一种预后不良的预测因子。而BAG?1与细胞凋亡在LSCC的发生机制中有明显的相关作用,BAG?1基因有可能通过抑制喉癌细胞凋亡,对喉癌的发生发展起重要作用。而抑癌基因p53则可能独立地起作用,但也不能排除限于样本数量的原因,p53与BAG?1也存在某种相关性的可能,这有待于进一步研究。继续深入研究和探索这些基因在肿瘤中的表达及相互作用，将对肿瘤的早期诊断和指导治疗有着重要的临床意义。

【】
  ［1］ Yang X, Hao Y, Ferenczy A, et al. Overexpression of anti?apoptotic gene BAG?1 in human cervical cancer[J]. Exp Cell Res, 1999,247: 200?207.

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[4] O'Driscoll L, Linehan R, M Kennedy S, et al. Lack of prognostic significance of survivin, survivin?deltaEx3, survivin?2B, galectin?3, bag?1, bax?alpha and MRP?1 mRNAs in breast cancer[J]. Cancer Lett, 2003,201(2): 225?236.

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[6] Shindoh M, Adachi M, Higashino F, et al. BAG?1 expression correlates highly with the malignant potential in early lesions (T1 and T2) of oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2000，36(5): 444?449.

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[10]Townsend PA, Cutress RI, Sharp A, et al. BAG?1: a multifunctional regulator of cell growth and survival[J]. Biochim Biophys Acta, 2003,1603(2): 83?98.