非小细胞肺癌中survivin蛋白的表达及其与 p53表达的关系

          作者：王静， 杨继要， 石敏， 吴逸明 ，吴拥军

【摘要】  目的 探讨非小细胞肺癌组织中survivin蛋白的表达与临床病理特征的关系及其与p53表达的相关性。方法 采用免疫组化的链霉菌抗生物素过氧化酶法（Streptavidin?Peroxidase,SP）检测80例NSCLC组织和20例正常肺组织中survivin、p53蛋白表达情况。结果 80例非小细胞肺癌组织中survivin蛋白阳性例数49例，表达率为61.3%，在肺良性病变组织中，未阳性表达，两组比较差异有显著性（P<0.05）；在III～IV期肺癌组织中survivin蛋白阳性表达率显著高于I～II期肺癌组织(P<0.05)，而与组织学分型、分化程度、 淋巴结转移与否无关(P>0.05)；survivin、突变型p53蛋白在肺癌组织中的表达呈正相关。结论 survivin蛋白表达与肺癌的TNM分期密切相关，有可能成为判断病情和评价预后的指标，survivin有望成为肺癌诊断的肿瘤标志物及基因的新靶点；survivin、突变型p53蛋白在肺癌组织的协同高表达可能促使肺癌病情的恶性。

【关键词】  非小细胞肺癌；survivin；p53；表达

    Corresponding Author: Wu Yi?ming,E?mail:wuym@zzu.edu.cnAbstract：Objective   To study the expression of survivin and its relationship with the clinical pathological features of the NSCLC(non?small cell lung carcinoma).Methods  The expression of survivin,p53 protein was detected in 80 cases of NSCLC tissues and 20 cases of normal lung tissue by immunohistochemical Streptavidin?Peroxidase (SP) method.Results  survivin was expressed in 49 of 80(61.3%)cases of lung carcinoma and in 0 of 20(0) cases of normal lung tissues with the expression of survivin in lung carcinoma significantly higher than that in normal lung tissues(P<0.05).The positive rate of survivin in stage Ⅲ～Ⅳwas significantly higher than that of survivin in stage Ⅰ～Ⅱ (P<0.05)；There was no relationship between survivin gene expression and histological subtypes,differentiation，TNM stages,lymph node metastasis (P>0.05),There is the positive correlation existing in the expression of Survivin,mutation?P53 in lung carcinoma.Conclusion  survivin with only expression in the cancer tissues,not in benign lung tissues，may play an important role in lung carcinogenesis and be identified as a definite diagnostic marker and a potential therapeutic target in NSCLC.Cooperative high expression of survivin and mutation?P53 in lung cancer tissues may make lung cancer develop quickly.

    Key words：NSCLC;survivin;p53;Expression

    本实验采用免疫组化方法，比较了正常肺组织和肺癌组织中survivin、p53表达的差异,探讨survivin与非小细胞肺癌的组织学分型、分化程度、淋巴结转移的关系及其与p53表达的相关性，为今后可能以survivin基因作为靶点对非小细胞肺癌对进行基因治疗和预后评价提供理论依据。

    1资料与方法

    1．1一般资料

    收集郑州大学第一附属2001～2003年手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌（NSCLC）标本80例，年龄33～79岁，平均年龄56.15±9.09岁，其中小于56岁组30例，大于或等于56岁组50例；鳞癌45例，其中高分化鳞癌16例，中分化鳞癌15例，低分化鳞癌14例；腺癌35例，其中高分化腺癌25例，低分化腺癌10例。临床分期：依据1997年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准[1]，Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期50例有淋巴结转移44例，无淋巴结转移36例。另取20例正常组织 (肺结核7例，支气管扩张症7例，肺炎性假瘤6例) 作对照。

    1．2方法

    采用链霉菌抗生物素过氧化酶（Streptavidin?Peroxidase，SP）免疫组化法。按SP试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）操作说明进行试验，所有样本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成厚4μm的切片，60℃烘烤，脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%非免疫血清封闭，加入1∶50稀释的兔抗人survivin多克隆抗体（美国Neomarkers公司）和鼠抗人p53单克隆抗体（美国Zymed公司）4℃过夜孵育，PBS冲洗，滴加1∶300生物素标记二抗，室温下30 min，冲洗，滴加1∶40 稀释的SP溶液，室温下30 min,冲洗后DAB（武汉博士德生物工程公司）显色,苏木素—伊红（HE）复染，封片。对照染色:免疫组化染色设阳性对照，以乳腺癌阳性标本作为阳性对照；阴性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

    1．3免疫组化结果判定及计数方法

    survivin蛋白阳性反应为淡黄至棕黄色颗粒，定位于胞浆；p53阳性反应为棕黄色颗粒，定位于细胞核。survivin蛋白阳性细胞的计数：按照Sinicrop[2]的标准作组织化学记分：H=N×I 。若H>1为阳性，若H≤1则为阴性。阳性细胞数记分（N）5个高倍视野阳性细胞数的百分率。共分5个等级： <5.0%；5.0%～25.0% ；26.0%～50.0%；51.0%～75.0%；>75.0%。着色强度记分（I）:1分??弱阳性(+)；2分??中度阳性（++）；3分??强阳性(+++)。p53染色阳性细胞的计数方法：每例标本随机选取10个高倍镜视野，计数1 000个细胞，阳性细胞百分率。阳性细胞百分率≥25%为阳性，<25%为阴性。阳性细胞不再进一步分级。

    1．4 统计学分析

    应用SPSS10.0统计分析软件，采用χ2检验，Spearman等级相关性分析，以P<0.05作为差异显著性的判定标准。

    2结果

    2.1survivin蛋白在肺癌和肺良性病变组织中的表达

    survivin蛋白的阳性反应为淡黄色颗粒，表达较强时呈棕黄色，主要定位于胞浆。肺癌组织的survivin蛋白阳性表达率为61.3%(49/80)，但在肺良性病变组织中，未见阳性染色，两组比较差异有显著性（χ2=24.020,P<0.05）。

    2.2survivin蛋白表达与肺癌病理特征的关系

    在III～IV期肺癌组织中survivin蛋白阳性表达率72.0%显著高于I～II期肺癌组织43.3%(P<0.05)；在无淋巴结转移（N0）组和有淋巴结转移（N1、N2）组中的阳性表达率分别与肺癌组织学分型、分化程度无关（P>0.05）,见表1。表1survivin蛋白表达与肺癌病理特征的关系

    2.3肺癌组织中survivin蛋白与p53蛋白表达的关系

    在survivin蛋白阳性表达的49例标本中，p53蛋白阳性表达37例，其余12例阴性表达；在survivin蛋白阴性表达的31例标本中，p53蛋白阳性表达7例，阴性表达24例；经统计学检验，二者呈正相关 (rs=0.518，P<0.05)。

    3讨论

    survivin基因是一种新发现的凋亡抑制基因，其表达产物survivin蛋白是一个由142个氨基酸组成的分子量大约16.2KD胞浆蛋白，在人类多种肿瘤中均有表达[3]。本研究结果显示，survivin在肺癌组织中表达显著高于肺良性病变组织（P<0.05）。提示survivin的表达与肺癌的发生有关，这为survivin作为肺癌诊断的标志物提供了理论依据。survivin蛋白表达与肺癌组织学类型、分化程度之间无明显关系。survivin在淋巴结转移组表达率高于无淋巴结转移组，但经处理差异无统计学意义。而survivin蛋白表达与肺癌TNM分期显著相关：survivin蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期表达率72.0%显著高于Ⅰ～Ⅱ期表达率43.3%(P<0.05)，造成这种结果的原因可能是样本数量不够大。综合[3]，提示survivin的阳性表达预示肿瘤有较高的侵袭性和不良预后，是判断肿瘤恶性程度、病情轻重及预后的指标。

    survivin的异常表达使细胞的正常凋亡机制受损，其可能机制为：（1）通过直接抑制caspase?3和caspase?7的活性从而阻止细胞凋亡进程进而导致肿瘤的发生、[4，5]；（2）间接抑制caspase?3： survivin蛋白与细胞周期素依赖性蛋白激酶?4（cyclin?dependent kinase4，CDK4）形成survivin/CDK4复合体，导致p21从p21/CDK4复合体中释放出来并和线粒体上的procaspase?3，形成procaspase?3/p21复合物使procaspase?3不能活化，从而阻止细胞凋亡途径，同时，p21的解离失去了对CDK4的抑制作用，促使Cyclin?CDK4复合物的形成，使细胞通过凋亡检查点进入S期，细胞进入增殖周期，最终导致大量细胞无限制增殖[6]。因此，survivin处于细胞增殖与凋亡通路中的关键位置，如果将survivin作为肿瘤基因诊断的靶点，将从多个方面抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。而p53与p21基因转录关系密切，当DNA受损伤时，野生型p53（wt?p53）大量增加并可促进p21基因转录，使p21蛋白合成增多并结合CDK4，抑制Cyclin?CDK4复合物的形成，使细胞停留在G1期，以便有足够的时间使损伤的DNA得以修复，如果修复失败，则wt?P53能够启动细胞凋亡程序，阻止DNA损伤细胞的继续分裂，从而阻止具有癌变倾向的细胞产生。为探讨p53与survivin在NSCLC中的关系，本研究检测了二者的表达，结果显示，突变型p53(mt?P53)与survivin蛋白的表达呈正相关。推测在非小细胞肺癌发生的过程中p53基因突变可能打破了wt?P53对survivin 蛋白表达的负反馈调节机制，从而使细胞凋亡受抑引起癌变，提示二者对肺癌的发生具有协同作用，联合检测此二种标记物对判断肺癌预后有一定价值。

【文献】
  ［1］ 董克伟.临床肿瘤学[M].第1版.北京：人民卫生出版社，2002.682?683.

[2]Tanaka K，Iwamoto S ，Gon G，et al.Expression of survivin and its relationship to loss of in breast carcinomas[J].Clin Cancer Res，2000，6（1）：127?134.

[3]Adida C，Crotty PL,Mograth S，et al.Developmentally regulated expression of the cancer anti?apoptosis gene Survivin in human and mouse differentiation[J].Am J pathol,1998，152(1):43?49.

[4]Kamihira S ，Yamada Y，Hirakata Y, et al.Aberrant expression of caspase cascade regulatory gene in adult T?cell Lenkaemia：Survivin is an important determinant for prognosis[J].Br J Haematol， 2001，114（1）：63?69.

[5]Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti?apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase?3 and?7[J].Biochemistry,2001，40(4):1117?1123.

[6]徐咏莲,刘少阳,江大琼.宫颈癌中survivin的表达及临床意义[J].肿瘤防治研究，2004，31（3）：145?147.