肺癌患者GSTT1多态性分布及其与15号染色体畸变的关系
【摘要】 目的 分析肺癌患者与对照GSTT1基因型多态性分布差异，探讨GSTT1基因型多态性对15号染色体稳定性的影响以及该染色体与肺癌发生之间的关联。方法 利用PCR技术分析了61例肺癌患者和46例对照的GSTT1基因型分布，以荧光原位杂交（FISH）技术分析了不同GSTT1基因型的14例肺癌患者和18例对照淋巴细胞15号染色体结构和数目畸变。结果 GSTT1+基因型（+/+和+/0）和GSTT1缺失基因型（0/0）在肺癌患者和对照之间的分布无显著性差异；肺癌组GSTT1+基因型15号染色体结构畸变率显著高于对照组GSTT1+和GSTT1 0/0型（P<0.05），但肺癌组0/0基因型未表现这种关系；15号染色体非整倍体发生率在各组和各基因型之间未表现显著差异。结论 GSTT1基因型多态性与肺癌风险、15号染色体的稳定性无显著相关，15号染色体结构畸变是肺癌的风险因素之一。
【关键词】 GSTT1；肺癌；染色体畸变；荧光原位杂交
Key words：GSTT1; Lung cancer; Chromosome aberration; Florescence in situ hybridization
谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S?Transferases,GSTs）是一个多功能酶家族，主要催化亲化合物与还原型谷胱甘肽共轭结合，形成亲水化合物并排出体外，该过程可使一些环境致癌剂、杀虫剂和多环芳烃解毒。人类基因组中，GSTs基因家族分为四型，即α、μ、π和θ，分别编码GSTM1、GSTM3、GSTP1和GSTT1，这些酶分别参与α?苯并芘、多环芳烃、单卤甲烷和氧化乙烯等化合物及其代谢物的解毒过程[1?3]。一些研究认为GSTT1基因型多态性影响潜在致癌物单卤甲烷、苯乙烯和1，3?丁二烯的环氧代谢物的解毒作用[2]，但其与肺癌风险的关系一直缺乏肯定的结论[4，5]。
本研究利用PCR和荧光原位杂交（FISH）技术，分析肺癌患者与对照的GSTT1基因型多态性分布，比较他们的15号染色体自发畸变频率，以期了解GSTT1基因型多态性—15号染色体畸变—肺癌之间的可能关联。
1材料与方法
经知情同意，外周静脉血取自昆明医学院第二附属未经化疗或放疗的肺癌患者（61例，年龄40～60岁），正常人血样（46例，年龄40～55岁）取自昆明市中心血站，肝素钠抗凝，每位志愿者取血3～4ml,分为二等份，分别进行DNA抽提和全血淋巴细胞培养。
1．1GSTT1基因型鉴定
外周静脉血与10倍双蒸水混合以破碎红细胞，常规氯仿/酚抽提基因组DNA。
GSTT1基因型分型采用常规PCR。GSTT1引物[6]由北京塞百盛公司合成， G1：5′?TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC，G2：5′?TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA；内对照（CYP1A1外显子7）引物：C1：5′?GGA CTG CCA CTT CAG CTG TCT，C2：5′?CAG CTG CAT TTG GAA GTG CTC。PCR反应体积为50μl ：5μl buffer、3μl MgCl2（终浓度1.6mM）、4×dNTP各1μl（终浓度200μM）、四种引物各1.5μl（终浓度60pM）、模板DNA 3μl、d H2O 27μl、1.5u Taq酶。预变性94℃ 4 min、 94℃变性60s、66℃退火60s、72℃延伸60s，35个循环后72℃终延伸2min。1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定GSTT1基因型，GSTT1+（+/+及+/0）扩增产物为312 bp，GSTT1缺失（0/0）基因型无相应条带；内对照扩增产物为480bp。
1．2荧光原位杂交（FISH）检测
取外周静脉血1～1.5ml置RPMI1640培养液中（10%小牛血清、适量PHA、双抗和肝素，pH6.8），37℃恒温恒湿培养76h，低渗、甲醇/冰醋酸固定、常规制片，室温空气干燥过夜，密封保存于-20℃，根据上述基因型分析结果，在每组样本的各种基因型中选取5～10例年龄相近者进行FISH分析，评价15号染色体的结构和数目畸变。
人类15号染色体探针α?卫星DNA（D15Z4，15p11.1?q11.1）和卫?III (D15Z1，15p11.2)探针购自Vysis公司，α?卫星为橘红色信号，卫?III为绿色信号，FISH过程遵循探针产品指南，主要过程为：片子置0.01% pepsin 37℃消化10 min，70%～85%～100% 乙醇4℃脱水各1min，70%甲酰胺/2X SSC 74℃变性 5 min，70%～85%～100% 乙醇4℃脱水各1min，电吹风冷风吹干。
将探针混合液（专用杂交缓冲液7μl、α?卫星和卫?III探针各0.5μl、dH2O 2μl）74 ℃水浴变性5min；5μl覆盖玻片样本，加盖片，橡胶水泥封片，42℃恒温恒湿杂交过夜。杂交结束后， 0.4×SSC/0.3% NP?40（pH7.0）74℃荡洗2min，2×SSC/0.1% NP?40中（pH7.0）浸泡30s，200μg/ml DAPI反染靶部位后加盖片，指甲油封片， -20℃避光保存或荧光显微镜观察。荧光信号分析利用带有三色滤片(DAPI,FITC 和 罗丹明)的Nikon E400 荧光显微镜进行，每一个体至少分析1 000个间期细胞核，染色体畸变分析包括结构畸变和数目畸变，前者包括断裂、缺失和重复，非整倍体包括单体和三体。
正常15号染色体包括紧密相邻的橘红?绿色信号，橘红色和绿色分别指示该染色体的着丝粒和近着丝粒区域。当一组信号的二个荧光斑点间距大于单个斑点半径时，判断为断裂；每个细胞核中信号超出或不足二组，且变化不以完整信号组合为单位时，判断为重复或缺失，若信号的增减以一组信号为单位，则为非整倍体，见图1。
1．3统计学分析
以Yates χ2校正检验分析肺癌及对照组GSTT1基因型多态性分布，One?way ANOVA分析比较乳腺癌患者和对照样本中不同GSTT1基因型15号染色体畸变频率及其差异。
2结果
实验结果显示：61例肺癌患者中GSTT1 0/0基因型个体为33例，占54.1%，46例对照组中GSTT1 0/0基因型个体为29例，占61.7%，肺癌和对照组中GSTT1+ 和GSTT1 0/0基因型频率分布无显著性差异,见表1。表1肺癌和对照组GSTT1基因型分布 a: Yates 卡方校正检验;a: Yates Chi?square corrected test 利用FISH技术评价18例对照和14例肺癌患者的淋巴细胞15号染色体畸变率，结果发现仅GSTT1+基因型的肺癌患者染色体结构畸变显著高于对照组GSTT1+ 和GSTT1 0/0基因型（P<0.05），而病例组GSTT1 0/0基因型的染色体结构损伤却与对照无显著差异；非整倍体频率在二组样本中的所有基因型之间都未表现显著性差异，见表2。表2GSTT1基因型与外周鉴于肺癌组GSTT1+基因型的染色体结构畸变频率显著高于对照，试验进一步分析了GSTT1基因型与15号染色体结构畸变的相关性。表3呈现了相关性分析结果，无论将肺癌和对照样本独立分析，或将二组样本的数据合并分析，GSTT1基因型多态性与15号染色体结构畸变间均未表现显著相关。表3GSTT1基因型多态性与 GSTs是机体在异源物代谢过程中的重要解毒酶系，在保护机体免受致癌化学物质攻击方面发挥着重要作用。GSTT10/0基因型导致相应的酶缺失，可使星细胞瘤和脑膜瘤的风险提高[7]，但该基因型与肺癌的关联研究尚存在许多矛盾的结论，一些研究认为该基因型可提高肺癌风险，一些研究则认为该基因型对肺癌发生有防范作用[4,5,7,8]。
本研究发现，肺癌患者GSTT1 0/0基因型占54.1%，对照占61.7%，分布无统计学差异，提示在本试验系统内，GSTT1基因型多态性与肺癌发生无显著关联。
研究还发现，肺癌GSTT+ 基因型15号染色体结构畸变率显著高于对照，但肺癌0/0基因型则未表现类似情况，该结果不仅提示15号染色体结构畸变是肺癌的风险因素，也暗示0/0基因型的遗传稳定性可能高于GSST1+；尽管在相关分析中，未发现GSST1多态性与15号染色体畸变的显著相关，但0/0基因型染色体畸变标记均低于GSTT1+的趋势暗示GSTT1缺失对遗传物质防护作用的可能性。Wenzlaff的研究曾提出GSTT1缺失对于非吸烟者基因组具有潜在的保护作用，使肺癌风险降低[9]，我们的研究中GSTT1+个体的遗传损伤背景偏高的倾向支持其观点。进一步研究需要扩大GSTT1基因型自发遗传损伤评价的范围，寻找不同基因型遗传损伤差异的机制，从而更深入探讨不同GSTT1基因型个体的代谢特性、遗传稳定性及其与肿瘤发生之间的关系。
云南师范大学吴瑕玉老师对本研究的统计学分析做了大量工作，特此致谢！
【】
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