肺癌中肿瘤抑制基因CEACAM1的选择性拼接与PTB的过表达有关
【关键词】 肺癌
Alternating Splicing of Tumor Suppressor Gene CEACAM1 is Correlated with Over?expression of PTB in Lung Cancer
Corresponding Author: YUAN Liu?di,E?mail:yld@seu.edu.cnAbstract：Objective The possibility of modulating the difference of CEACAM1 splicing pattern between tumor tissues and their corresponding non?malignant lung tissue.Methods Detect the expression pattern of CEACAM1 in non?small cell lung cancer (NSCLC) by Hot?PCR,mini?gene constructs and co?transfection with PTBs.Results The RNA transcript from this mini?gene could be spliced in a cell?specific manner.The exon 7 was predominantly included in H1944,but predominantly excluded in 22B.Over?expression of PTB could ubiquitously alter the ratio of CEACAM1L and CEACAM1S.The amount of CEACAM1L was decreased in a dosage?dependent manner.Conclusion We identified polypyrimidine tract binding protein (PTB) as the splicing factor that involves in inclusion / exclusion of CEACAM1 exon 7.A clear correlation was found between over?expression of PTB and the alternative processing of CEACAM1.
Key words：CEACAM1;Alternative splicing;PTB; Mini?gene
择性拼接而产生的两种变体在小细胞肺癌及癌旁组织中表达比例不同的调控机
制。方法 通过Hot?PCR检测小细胞肺癌中CEACAM1的两种产物的表达；Western blot分析PTB在小细胞肺癌组织的表达；用PCR方法获得CEACAM1基因中从内含子5至外显子8长1,606?bp DNA片段插入到真核表达载体pCMV中，构建成CEACAM1迷你基因模型并与PTB基因共转染，PCR法鉴定转染后的产物变化。结果 PTB过表达与CEACAML的低表达有明显的相关性。PTB三种变体使CEACAM1L表达下降，其中PTB4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中CEACAM1L在两条带中所占比例为76.7%，而与PTB三种变体共转染后，比例分别下降至58.3%、64.8%和54%。结论 拼接因子PTB与CEACAM1的选择性拼接有关。
关键词：CEACAM1;选择性拼接;PTB;迷你基因
肺癌为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，而肺癌的病因和发病机制尚未明确。从分子生物学角度看，细胞癌变是多因素、多阶段、多基因变异的结果。这些改变与抑癌基因失活有很大的关系［1］。
癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(CEACAM1，C?CAM1)，是一种跨膜糖蛋白［2］，在多种上皮细胞起源的肿瘤中起肿瘤抑制基因作用，属于免疫超家族基因。该基因长约1.48 kb，共有9个外显子组成，其中第七外显子长53 bp，位于CEACAM1的胞内端，在选择性拼接中可被选择性去除，从而产生两种变体，即CEACAM1L和CEACMA1S。CEACMA1L含外显子7，因此胞内端较长，而在CEACAM1S的形成中，由于外显子7被剪切去除产生移框，其胞内端少了73个氨基酸。有研究表明，CEACAM1在多种肿瘤如肠癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌中普遍下调［3］。当老鼠的CEACAM1L被转入鼠的肠癌或乳腺癌等细胞时，细胞的生长速度明显减慢，恶性程度降低［4?6］。Estrera等［7］ 研究认为仅表达CEACAM1L的胞内部分即能产生抑制肿瘤生长的作用，因此CEACAM1L的胞内端对抑制肿瘤的生长是必需的。但在肺癌的发生中，CEACAM1的表达与其他肿瘤有明显的不同。根据RNA原位杂交和 Northern blot分析，CEACAM1L在75%的肺癌旁组织高表达，而CEACAM1S在84%的肺癌中高表达［8］。为了研究肺癌发生过程中两种变体表达谱改变的调控机制，我们采用了迷你基因模型与PTB共转染,实验证明CEACAM1的选择性拼接与PTB有关。
1材料和方法
1.1菌株及试剂
大肠杆菌DH5α由本实验室保存。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa 公司，CompleteTM protease inhibitor cocktail购自Roche公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。Hotstar Taq DNA Polymerase 购自Qiagen公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养
H1944、22B由美国M.D.安得森癌症中心毛力先生惠赠。细胞在37°C、5% CO2、DMEM/F12培养基（5%的小牛血清，100U/ml 青霉素和100μg/ml 链霉素）中生长。
1.2.2RT?“Hot”?PCR
RT?“Hot”?PCR用末端标记32P的引物进行，上游引物：5’? GGTTGCTCTGATAGCAGTAG?3’，下游引物：5’? AGCCTGGAGATGCCTATTAG?3’，来扩增细胞中 CEACAM1两种表达产物，分别为CEACAM1L（408bp）和CEACAM1S(355bp)。PCR反应体系为12.5μl，含7%DMSO，1.5mM dNTP，6.7mM MgCl2，16.6mM (NH4)2SO4，67mM Tris,10mM β?巯基乙醇，6.7mM EDTA，1.2mM 引物，0.625U的Hotstar聚合酶。反应条件如下：95℃变性30s，60℃退火1min，70℃延伸1min，25个循环，PCR产物行6%聚丙烯凝胶电泳，压X光片。
1.2.3Western blot分析PTB表达
抗PTB的单克隆抗体由冷泉港实验室David Helfman惠赠。按［9］提取临床标本的核蛋白，1X上样缓冲液（SDS loading buffer）溶解，煮沸5min处理后，行SDS?PAGE。100V、1.5h将蛋白转至PVDF膜上，在含有20%Tween?100的TBS（TBST）溶解的脱脂奶粉中封闭1h，PTB作为一抗（1∶200）室温孵育1h，TBST清洗8次，每次5ml，带有HRP标记的羊抗兔的二抗室温孵育1小时，TBST清洗8次，每次5ml，加入发光底物，X光片感光显色观察。
1.2.4CEACAM1 迷你基因重组质粒的构建
用PCR方法获得CEACAM1基因中从内含子5至外显子8长1 606?bp DNA片段插入到真核表达载体pCMV中，重组质粒经测序鉴定。引物序列为：5’?GGGAATTCCCATGACAaATAATGCTCTACC?3’和5’?GGTACCCTTGTTAGGTGGGTCATTGG?3’。为了避免内含子5和外显子6的连接处拼接位点核苷酸序列可能的影响，我们将内含子5拼接位点内的“ag”突变为“aa”。
1.2.5迷你基因与PTB共转染
我们选用主要表达CEACAM1L的H1944细
图1CEACAM1L and CEACAM1S
在NSCLC细胞株中的表达图4H1944细胞株中与PTB
共转染后迷你基因L/S?表达谱
图2肺癌组织中PTB的western blot分析
PTB高表达和 CEACAM1L的低表达
图3重组载体的构建
胞株作为CEACAM1迷你基因与PTB的瞬时转染的宿主细胞，实验按Lipofect AMINETM 转染试剂盒操作说明书进行。细胞在100?mm 培养皿中长至约 80%，加入DNA/lipofect AMINETM混合物(10μg/40 μl，室温放置40min)和4ml 无血清、无抗生素的培养基混合物加入细胞中，37℃培养6h后，更换为含有血清、抗生素的培养基。转染72h后收集细胞，用RNAzol提取总RNA，每种载体重复转染3次。用位于外显子6中的序列作为引物S1：5'?GGTTGCTCTGATAGCAGTAG?3'和载体上的T7序列为引物：5’?TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA G?3’，来扩增转染的 CEACAM1迷你基因的表达产物。PCR反应条件如下：94℃变性1min，55℃退火1min，72°C延伸2min，25个循环，PCR产物经测序鉴定。
2结果
2.1RT?“Hot”?PCR
RT?“Hot”?PCR结果见图1，CEACAM1两种产物的表达有细胞特异性，在H1944及A549细胞株中，主要以CEACAM1L的形式存在，而在大部分其他细胞株中，则主要以CEACAM1S的形式存在。
2.2PTB的Western blot分析
Western blot分析的结果见图2，PTB高表达与CEACAM1L低表达有明显的相关性。在肿瘤组织中，PTB明显高表达，而CEACAM1L表达水平较癌旁组织明显下降。
2.3重组载体的构建
PCR得到的约为1.6kb的DNA片段，经酶切连入真核表达载体pCMV，构建的重组载体经测序鉴定无误，阅读框不变。
2.4迷你基因的表达及与PTB共转染
我们选用主要表达CEACAM1L 的H1944细胞株作为迷你基因及PTB重组载体瞬时转染的宿主细胞，用PCR方法检测表达产物的变化，见图4。PTB三种变体都影响迷你基因的表达产物的比例，都使CEACAM1L表达下降，其中PTB4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中CEACAM1L占比例为76.7%，而与PTB三中变体共转染后，比例分别下降至58.3%、64.8%和54%。
3讨论
真核生物基因由外显子与内含子组成，通过转录形成的mRNA前体必须去除内含子，将外显子拼接起来，才能形成成熟的mRNA，作为翻译的模板。拼接有组成型拼接与选择性拼接两种，是基因表达的必经阶段，也是转录后遗传信息扩展的重要机制。有研究表明，人类因基因突变所致的疾病中，有15%是由于拼接异常引起的。尽管拼接的缺失与肿瘤的因果关系还不十分清楚，但很多实验结果表明，人肿瘤中有很多基因产物的比例发生了变化。
CEACAM1基因通过其外显子7的选择性拼接产生两种变体，即CEACAM1L 和CEACAM1S 。CEACAM1L的胞内部分是其具有肿瘤抑制活性所必需的，当去除第七外显子后成为CEACAM1S，则失去其肿瘤抑制活性。有报道，在84%的小细胞肺癌组织中及大多数非小细胞肺癌细胞和小细胞中，CEACAM1L 的表达水平均下降［10］。为了研究CEACAM1外显子7的选择性拼接机制，我们将CEACAM1基因中从内含子5至外显子8长1 606?bp的DNA序列插入到真核表达载体pCMV中，并转染H1944，以此检测从CEACAM1同一个mRNA前体是否能产生两种变体。为了避免内含子5和外显子6的连接处拼接位点核苷酸序列可能的影响，我们将内含子5拼接位点内的“ag”突变为“aa”。实验结果表明，迷你基因的表达产物CEACAM1L和CEACAM1S是从同一mRNA前体经选择性拼接而产生的。
PTB是hnRNP家族的一员，识别富含嘧啶的的核苷酸序列，能与U2AF竞争结合位点，在一些外显子选择剪切过程中起负调控作用，能抑制外显子的剪切。文献报道的PTB调控的基因有FGFR?1,GABAA receptor γ2,c?src,fibronectin,and α? or β?tropomyosin。Western blot分析的结果表明，PTB高表达与CEACAM1L低表达有明显的相关性。为了研究可能参与CEACAM1外显子7的选择性拼接的拼接因子，我们将CEACAM1迷你基因模型与三种PTB?pCDNA共转染细胞株，实验结果表明，PTB三种变体都影响迷你基因的表达产物的比例，CEACAM1L所占比例分别下降至58.3%、64.8%和54%。
至此我们建立了研究CEACAM1选择性拼接的细胞模型，初步探讨了PTB与CEACAM1 外显子7的选择性拼接的相关性，为进一步研究PTB对CEACAM1 外显子7选择性拼接的调控及在肿瘤发生过程的作用研究奠定基础。
【文献】
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