苏拉明联合槲皮素抑制肺腺癌小鼠移植瘤 的转移

           作者：张平，贺兼斌，王小华，欧立文

【摘要】  目的 研究苏拉明联合槲皮素对小鼠肺腺癌转移的抑制作用。方法 将40只接种高转移性的LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分成5组：对照组、顺铂（DDP）组、槲皮素组、苏拉明组、苏拉明+槲皮素组。实验3周后，处死全部小鼠，取出双肺和剥离皮下肿瘤，肺转移发生率，计数各组小鼠肺表面转移结节数及算出肺表面结节转移抑制率，测量各组小鼠肺湿重。免疫组化和图像分析系统检测皮下移植瘤中微血管密度（microvessel density，MVD），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达并定量分析。结果 苏拉明组、槲皮素组与对照组相比肺表面转移结节数明显下降，同时苏拉明组中肺转移发生率、皮下肿瘤内MVD 、VEGF的表达与对照组相比也明显下降，相反顺铂组对此则无明显影响。联合用药组则显著抑制肺表面转移结节数且具有协同作用。结论 苏拉明和槲皮素对LA795肺腺癌的肺结节转移具有协同抑制作用，苏拉明抑制LA795肺腺癌转移与其抑制其肿瘤内VEGF表达相关。

【关键词】  苏拉明；槲皮素；血管生成抑制剂；肺腺癌；转移

基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目(C2005033)
    Inhibitory Effect of  Suramin  Combination with  Quercetin on the Metastasis of Lung Adenocarcinoma in Mice

       Key words：Suramin;Quercetin;Angiogenesis;Lung?adencarcinoma;Metastasis

    目前肺癌发病率和死亡率都有明显增高趋势，腺癌为其一主要组织学类型，癌瘤内血管丰富，局部侵润和血行转移发生较早。转移是恶性肿瘤的重要特征，也是主要死因。自Folkmam[1]首先提出实体瘤生长需要血管生成理论后，抗血管肿瘤转移也成为了当前肿瘤生物治疗的研究热点之一。本实验利用LA795肺腺癌细胞形成高转移T739小鼠皮下肿瘤转移动物复制模型 [2]，应用具有血管生成抑制作用的苏拉明及槲皮素，以顺铂为对照，观察单独及联合用药对LA795肺腺癌肺转移的抑制作用，并探讨其作用机制。

    1材料和方法

    1.1实验动物、细胞株、药品及试剂

    T739雄性小鼠40只，鼠龄4～5周，均重20g左右， LA795肺腺癌荷瘤鼠两只，均由医学院肿瘤动物室提供（合格证号SCXK11?00?0005），南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司，苏拉明（Suramin）及槲皮素（Quercetin）购于美国Sigma公司，VEGF兔抗鼠单抗购于美国Santa Cruz生物科技公司，CD34免抗鼠一抗、广谱型SP试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物工程公司。

    1.2动物模型的建立

    处死两只荷瘤鼠，剥离瘤块，研磨成匀浆液，过360目钢网，生成肿瘤细胞悬液，镜下调节细胞浓度为2×106个/ml，于每只小鼠右后腿根部外侧皮下注射0.2ml瘤液，形成小鼠高转移性动物肿瘤模型。

    1.3分组及用药

    小鼠皮下移植处均成瘤，接种4d后随机分成5组，每组8只。(1) 对照组:丙二醇0.2ml+生理盐水0.2ml /只腹腔注射（iq），每天一次；(2) 顺铂组:顺铂2mg/(kg·d)溶于生理盐水0.2ml中iq，于接种后第4、11、18d各一次，并予丙二醇0.2ml/只每天腹腔注射一次；(3) 槲皮素组:槲皮素50mg/(kg·d)溶于丙二醇0.2ml中iq，每天一次；(4) 苏拉明组:苏拉明10mg/(kg·d)溶于生理盐水0.2ml中iq，每天一次；(5) 槲皮素+苏拉明组:槲皮素及苏拉明按3、4组用药。

    1.4方法与观察指标

    1．4．1药物对肿瘤转移的影响

    肿瘤接种24d处死小鼠，剥离皮下肿瘤，剖胸观察双肺表面肿瘤转移情况，计数肺表面转移结节数，肺表面结节转移抑制率=（1?用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%,称肺湿重。肺及皮下肿瘤置入4%的中性甲醛固定，石蜡包埋，组织切片（4μm）行HE染色及免疫组化染色。

    1．4．2移植瘤内VEGF、MVD的表达

    采用免疫组化SP法检测，方法步骤严格按试剂盒说明书进行（皆1∶100稀释为工作液），用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。VEGF的判定标准，肿瘤细胞浆及胞膜呈棕黄色为阳性细胞，Luzex?F图像分析系统测定肿瘤组织中VEGF平均灰度值(其灰度值越低，则VEGF表达水平越高，反之亦然)，将每张切片在40倍镜下随机测10个视野，用平均灰度值评价染色强度。MVD判断标准Weidner等[3]方法。结果以±s表示。

    1．5统计处理

    根据数据类型分别使用组间t检验，χ2检验和相关分析，用SPSS10.0软件进行统计学处理。

    2结果

    2.1移植瘤的肺转移情况

    各组小鼠移植瘤的肺转移发生率、肺转移结节数、肺湿重等情况,见表1。表1各组小鼠移植瘤的肺转移情况

    3讨论

    已发生转移的中、晚期肺癌疗效差。肿瘤侵袭和转移是肿瘤的一大难题。本文用有血管抑制作用的苏拉明联合槲皮素对肺腺癌的转移进行研究。

    结果显示，联合组肺表面转移结节数比其他组明显减少，有差异显著性(P<0.05)，说明苏拉明和槲皮素联合应用有协同抑制转移作用。槲皮素组、DDP组及对照组小鼠均发生肺转移，差异无显著性（P＞0.05）；苏拉明组6/8小鼠发生肺转移，低于对照组，而联合组5/8小鼠发生肺转移与对照组比差异有显著性(P<0.05)，进一步显示联合用药协同作用。本实验苏拉明组及槲皮素组与对照组转移率相比无显著性差异，可能是本研究样本偏少，扩大样本可能会得出阳性结果，5组肺湿重无差异显著性，可能与肺表面转移结节局部未明显生长有关，延长喂养时间，随着转移灶局部生长估计会导致各组肺湿重的差异性。亦可能系转移瘤所占肺比重较小，如测转移瘤重，亦可能出现差异性，但本研究中肺脏体积小，癌结节难以剥离。

    体外实验证明，缺乏血管生成，肿瘤只能长到1～2mm3，不发生转移，血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移的基础，新生血管提供肿瘤生长所需营养，排泄代谢产物，促进血管渗漏，大量癌细胞进入血液循环，是癌细胞播散的途径。肿瘤生长和转移需要新血管持续生长［4］。血管形成过程的核心是血管内皮细胞增殖，VEGF是最重要的血管生长因子，是血管内皮细胞的特异性致裂原，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种络氨酸激酶受体，促进内皮细胞分裂，增殖和血管构建，诱导微血管生成，增加血管通透性，它还能降解血管内皮细胞基质，削弱血管的屏障作用，使新生血管基底膜缺损加重，促进肿瘤的侵袭及转移［5,6］。本实验证实苏拉明组、槲皮素组和联合组中VEGF的表达较对照组及DDP组低，有显著性差异（P<0.01），VEGF的表达在肿瘤侵润的边缘尤为增强，且和肿瘤内MVD有一致性，说明苏拉明和槲皮素可抑制肿瘤内血管生成，切断肿瘤营养供应和肿瘤转移通道，抑制肿瘤的转移。我们同时观察到苏拉明与槲皮素联合能增强血管抑制作用，可能与槲皮素亦有抑制血管增殖的活性有关［7］，两者具有协同作用。结合 VEGF表达灰度值和肺表面转移结节数呈负相关(r=-0.88,P<0.01)，提示VEGF是监测肿瘤转移的较好指标。苏拉明和槲皮素可通过下调这些蛋白质表达而抑制肿瘤转移，说明抑制血管生成为苏拉明和槲皮素抑制肿瘤转移的机制之一。

    综上所述，苏拉明和槲皮素对LA795肺腺癌的肺转移有抑制作用，联合应用有协同作用；它们抑制LA795肺腺癌转移与其抑制肿瘤内VEGF表达相关，其具体相关机制尚需进一步探讨。

【】
  ［1］ Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeatic implication [J].N Eng J Med,1971,285(20):1182?1186.

[2]张兆伟，张金芝，孙文义，等.小鼠肺腺癌LA795细胞株的建立及一些生物学特性的研究[J].中华肿瘤杂志，1985，7（2）：83?85.

[3]Weidner N.Tumor angiogenesis: Review of current application in tumor prognosis [J].Semin Diagn Pathol,1993,10(4):302?313.

[4]Kerbel RS.Tumor angiogenesis:past,present and the near future[J].Carcinogenesis,2000,21(3):505?515.

[5]Kwak BK,Shim HJ,Park ES,et al.Hepatocellular carcinoma:correlation between vascular endothelial growth factor level and degree of enhancement by multiphase contrast?enhanced computed tomography[J].Invest Radiol,2001,36(8):487?492.

[6]Yoshiji H,Kuriyama S,Hicklin DJ,et al.the vascular endothelial growth factor receptor KDR/Flk?1 is a major regulator of malignant ascites formation in the mouse hepatocellular carcinoma model[J].Hepatology,2001,33(4):841?847.

[7]吴凯南，钟晓刚，马桑慰，等.槲皮素对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其对血管生成的影响[J].肿瘤临床，2003，30（6）：434?438.