与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

             作者：杨继要,张慧珍,王静,吴逸明,买淑鹏

【摘要】  目的 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。 方法 以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株，再经PCR进一步鉴定，确定含有单链抗体基因的克隆并测序，测序结果通过GeneBank 比对进行同源性分析。结果 获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA 测序后,在Genebank 中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤奠定了基础。

【关键词】  肺癌；噬菌体抗体库；HSP70；筛选

    Identification and Sequence Analysis of Fused scFv  Antibody Binding Specifically to HSP70

    Key words：Lung cancer；Phage antibody library；HSP70；Biopanning

    热休克蛋白70（Heat Shock  Protein 70,HSP70）在很多肿瘤中高表达，研究表明[1，2]，肿瘤细胞的HSP70特异性表达于细胞表面，与正常组织细胞的细胞内表达不同。

    本研究从构建的人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选抗HSP70抗体，旨在寻找有临床应用价值的抗体，为肺癌免疫治疗奠定理论基础。

    1材料和方法

    1.1材料 人源性肺癌噬菌体单链抗体库由我室张慧珍博士构建，库容为1.2×1012，-70℃保存。TG1大肠杆菌、KM13辅助噬菌体为本实验保存。鼠抗M13 单克隆抗体购自Amersham 公司。鼠抗人HSP70一抗、兔抗鼠二抗购自北京中山公司，抗原HSP70由我研究室从肺癌组织中提取总蛋白，经过ConA亲和柱、透析、DEAE离子交换柱获得，经WESTERN-BLOT 鉴定具有抗原性。胰酶及其他试剂为国产分析纯。

    1.2方法

    1.2.1辅助噬菌体的制备方法参照Griffine噬菌体抗体库操作手册:辅助噬菌体M13扩增并定量稀释到1×1012 pfu/ml,分装后置4℃保存。

    1.2.2 噬菌体抗体库的扩增和抗体库滴度测定

    (1) 噬菌体抗体库的扩增取100μl原库菌液，接种到100ml 2YT-AG（含100μg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖的2YT）培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；加1ml辅助噬菌体KM13于25ml培养液，37℃水浴30min，4℃离心后弃上清；用50ml 2YT-AK（含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素的2YT）重悬沉淀，37℃培养过夜；4℃离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。加10ml PEG/NaCl 于上清中，冰浴1h后离心弃上清，用PBS洗涤沉淀，再重悬于含15%甘油的PBS中，-70℃保存。

    (2) 抗体库滴度测定取1μl浓缩后的抗体库上清，用PBS 100倍梯度稀释，每个稀释度均加入900μl 新鲜制备的大肠杆菌TG1（OD600＝0.4），37℃水浴30min后涂TYE平板，37℃培养过夜。次日计数菌落估计噬菌体抗体滴度：用噬菌体颗粒的菌落形成单位表示，pfu/ml＝集落数×稀释倍数。定量稀释到1×1012 pfu/ml保存。

    1.2.3以肺癌组织中纯化的HSP70为抗原对抗体库进行四轮筛富集选  以纯化的HSP70（10μg/ml）包被酶标板4个孔，室温放置过夜；次日用2%MPBS（含2%脱脂奶粉的PBS）室温封闭，每孔加1μl融合抗体上清和100μl 2%MPBS，室温孵育；弃上清，洗孔后，加入含胰酶的PBS 400μl 洗脱噬菌体；加200μl洗脱液于1.8ml OD600=0.4的TG1菌液中，37℃水浴30min后，取10μl涂TYE平板，37℃培养过夜，次日从TYE板上刮下菌落，所得到的菌落被扩增并用于制备下一轮筛选用噬菌体。剩余则测噬菌体抗体滴度。共进行四轮筛选。每轮投入和产出率。

    1.2.4抗体库的初步鉴定

    (1) 从单个含噬菌粒细菌克隆制备融合抗体

    从每一轮筛选后过夜培养的TYE平板上随机挑取12个单个细菌克隆，接种到含200μl 2YT-AG 的酶标板孔中，37℃振荡培养过夜，标记为母板；另取一块酶标板，标记为检测板，每孔加200μl 2YT-AG，从母板中取10μl过夜培养物于检测板相应孔中，37℃振荡培养1h；每孔加入1μl辅助噬菌体KM13，37℃振荡培养1h。离心弃上清，每孔加200μl 2YT-AK，培养过夜，离心，上清即表面表达有融合抗体的单克隆噬菌体，4℃保存。

    (2) 单克隆噬菌体与HSP70结合的ELISA检测  抗原HSP70包被酶标板（操作同上），向每孔加50μl单克隆噬菌体抗体上清液，2%MPBS洗涤后，加入二抗HRP-anti-M13；阳性对照为一抗（鼠抗人HSP70），二抗（兔抗鼠lgG）；阴性对照仅加入2%MPBS。以TMB为底物,2M 硫酸终止反应,取经酶标仪检测OD405～OD630的平均值，以OD值大于阴性对照平均值的2倍,判断为阳性。

    1.2.5质粒提取及PCR 扩增  将第四轮筛选后获得的阳性克隆菌接种平板培养过夜,挑取单克隆菌接种液体培养基,培养后提取质粒,PCR 扩增。引物 VH10 5’TTATCATCGAGCGGCCNNNNNGGCCGAGGTGCAGCTGKTGGAG3’（K=T，G）和引物 VL1/2 5’GTTATGGTCGAACGCGCGGCCGCTAGGACGGTSASCTTGGTCC3’（S=G，C）， 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

    1.2.6单链抗体DNA序列测定及核苷酸序列分析  PCR 扩增阳性菌由上海基康生物公司测序,所得序列在GeneBank 中与人的免疫球蛋白库进行比对,并进行可变区序列分析。

    2结果

    2．1 初级噬菌体抗体库滴度 含重组噬菌粒的库容为1.2×1012的抗体库经KM13辅助噬菌体辅助感染后，得到表达融合抗体的初级噬菌体抗体库，滴度为4.2×1016 pfu/ml。

    2.2噬菌体淘洗产率  以纯化的肺癌相关蛋白HSP70为抗原进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，洗脱的噬菌体产率显示第四轮与第三轮的回收率相近,说明经过筛选后阳性克隆已得到富集,见表1。表1各轮筛选过程中噬菌体的回收率

    筛选次数投入量产出量回收率（%）1                 4.2×10138.0×1021.9×10-92                 2.4×10132.0×1058.3×10-73                 3.0×10134.2×1061.4×10-54                 4.0×10137.2×1061.8×10-5

    注：回收率( %)=投入噬菌体量/产出噬菌体量×100%2.3单克隆噬菌体抗体与HSP70结合的ELISA检测结果 从四轮中每轮随机挑取12个单细菌克隆制备噬菌体融合抗体，与包被的HSP70抗原反应经ELISA检测，共得到5个阳性克隆（第一轮0个，第二轮1，第三轮1个，第四轮3个）。

    2.4阳性克隆菌的质粒PCR鉴定结果5个阳性菌经质粒提取后行PCR 扩增,经凝胶电泳,可见只有1 个克隆片段为800bp左右,符合抗体片段的理论值,见图1。

    2.5单链抗体DNA序列分析结果 将筛选出的1个单克隆菌交上海基康生物公司采用通用引物LMB3 测序,所得序列在GeneBank 中进行对比,结

    图1质粒PCR电泳鉴定图

    果表明该克隆含有人类免疫球蛋白同源序列,测序结果(VH + Linker + VL)如下,下划线部分为Linker。

    3讨论

    近几年来随着更多肿瘤相关抗原的发现，基因工程抗体技术的日渐完善，新一轮以抗体为导向的肿瘤又开始备受关注[3]。20 世纪90 年代初,人们将噬菌体展示技术应用于抗体克隆和表达,使抗体的制备技术产生突破性的进展[4，5]，与传统的杂交瘤技术相比,噬菌体展示技术筛选容量大，简便，易于进行抗体的改造，并且不需经免疫即可大量制备抗体，因此在肿瘤的诊断和治疗，肿瘤疫苗研制方面应用前景广阔[6] 。

    HSP70 在很多人类肿瘤组织细胞中均有较高的表达，肿瘤来源的HSP70 诱导的抗肿瘤免疫是当前研究的热点。以往的研究表明[2，7]，HSP70激发有效抗肿瘤免疫效应的抗原性来源于它所结合的多肽，而不是HSP70本身。但是，根据肿瘤细胞的HSP70特异表达于细胞表面，而正常细胞则是细胞内表达的特性，作者推测，可以利用该特性，制备肿瘤源性的HSP70抗体，使HSP70可作为肿瘤相关抗原而不是仅仅作为“肿瘤抗原载体”或者“免疫佐剂”来诱导的抗肿瘤免疫，成为以HSP70为基础的肿瘤靶向治疗的另一个切入点。

    本研究作为先期研究工作，以肺癌组织中纯化出的具有抗原活性的HSP70作为抗原，从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选HSP70抗体，经四轮筛选，得到富集后的噬菌体抗体库。从四轮随机挑取的48个菌落中，经单克隆噬菌体抗体与HSP70结合的ELISA检测出中鉴定5个含单链融合抗体的阳性克隆，经随后的PCR鉴定，在1株阳性克隆中获得与理论值一致的DNA扩增片段，进一步序列分析表明该克隆含有完整scFv 基因片段,在GeneBank 中与人免疫球蛋白文库比对表明，其具有完整开放阅读框,其插入序列的相应酶切位点及Linker 序列与载体图谱完全吻合，本研究为下一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。

【】
  ［1］ Multhoff C,Botzler C,Wiesent M,et al.A stress?inducible 72?Kda?heat shock protein (HSP) is expressed on the surface of human tumor cells but not on normal cells[J].Cancer,1995,61(4): 272?273.

[2] Ferrarini M,Heltai S,Zocchi MR,et al.Unusual expression and localization of heat shock proteins in human tumor cells [J]．Int J Cancer,1992，51(4)：613?619.

[3] Romanov VI.Phage display selection and evaluation of cancer drug targets[J].Curr Cancer Drug Targets,2003,3(2):119?129.

[4] McCafferty J,Griffiths AD,Winter G,et al1 Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains[J].Nature,1990，348(6301):552?554.

[5] Kang AS,Barbas CS,Janda KD,et al.Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab library along phage surfaces[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(10):4363?4366

[6] Hoogenboom HR.Overview of antibody phage-display technology and its applications[J].Methods Mol Biol,2002,178:1?37．

[7] 刘志勇,董 驹,张树波,等.人肺腺癌GLC?82 细胞热休克蛋白70 多肽复合物的提取及对细胞毒性T 淋巴细胞作用的实验研究[J].肿瘤防治研究,2005,32(3):141?143.