PCR?SSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究
【摘要】 检测Fas相关死亡结构域蛋白（Fas?associated death domain protein，FADD）基因在人非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）中的突变情况，以探讨该基因在肺癌发生中的作用及机制。方法 采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（polymerase chain reaction and single?strand conformation polymorphism, PCR?SSCP）检测74例NSCLC原发灶癌组织及13例癌旁正常肺组织中FADD基因突变情况。结果 74例NSCLC组织中检出5例发生FADD基因突变，FADD基因突变与癌的淋巴结转移呈显著正相关（rs=0.378，P=0.001），与其他临床病理特征无关。结论 NSCLC中存在着FADD基因突变。FADD基因突变在NSCLC的发生发展中可能起着重要作用。
【关键词】 肺肿瘤 突变 FADD基因 PCR?SSCP
0 引言
肺癌组织中癌细胞凋亡水平受抑是肺癌发生发展的重要机制之一，涉及到一系列凋亡相关基因的改变及异常表达[1,2]。参与调控细胞凋亡的蛋白很多，研究证实Fas相关死亡结构域蛋白（Fas?associated death domain protein，FADD）是一种具有普遍意义的死亡结构域蛋白，在多种细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡过程中起着关键作用[3?5]。NSCLC中存在着多种凋亡相关基因的突变[6]，而有关肺癌组织中FADD基因突变的研究，国内外报道尚为少见。为此，我们应用PCR?SSCP技术检测FADD基因在NSCLC中的突变情况，以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。
1 资料与方法
1.1 标本 62例肺癌组织及13例癌旁正常组织标本取自武汉大学医学院病理教研室存档的1998年1月～2002年7月的组织蜡块，12例新鲜肺癌组织为2002年6月～2003年3月武汉大学人民胸外科手术切除标本。男性50例，女性24例；年龄43～71岁，中位年龄56岁。按照WHO标准（1999年第3版）进行组织学分类，鳞癌31例，腺癌43例；按国际抗癌联盟（UICC，1997年第5版）TNM分期，T1期17例，T2期17例，T3期21例，T4期19例；N0期31例，N1期25例，N2期18例。
1.2 模板DNA的提取 石蜡包埋组织模板DNA的提取[7]进行。新鲜肺癌组织DNA抽提，具体方法参见分子克隆酚－氯仿抽提法。
1.3 PCP?SSCP?银染 我们选取FADD基因的第一外显子区域扩增，其引物序列，见表1。50μl反应体系，含1×PCR缓冲液，1.5mmol/L Mgcl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5μmol/L 引物，5μl模板，2u Taq酶；PCR扩增反应条件为：94℃预变性12min；94℃变性30s，50℃～60℃退火30s，72℃延伸30s， 35个循环； 72℃延伸5min。扩增完毕后，取6μl PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增成功并无非特异性扩增后，再作SSCP。取3～4μl PCR产物，加9μl H2O及1.5μl 10×碱变性液（NaOH 0.5mol/L，EDTA 10mmol/L），37℃孵育10min后加1.5μl变性上样缓冲液（98％去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.25％溴酚篮），吸取10μl上样于8％聚丙烯酰胺凝胶（29∶1），同等量100bp DNA Marker作分子量对照。15V/cm电泳10min后，将电泳槽置于冰水浴，12V/cm电泳直至溴酚篮到达凝胶底部。电泳结束后，小心取下凝胶，行银染。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因外显子突变。
表1 FADD基因外显子1的PCR引物序列（略）
1.4 统计学处理 本组所得数据采用χ2检验和Spearman相关分析，数据统计在SPSS10.0软件上进行，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
FADD基因第一外显子在74例NSCLC组织和13例癌旁正常肺组织中均全部扩增成功，见图1；癌组织中FADD基因第一外显子扩增产物有5例出现异常泳动条带(6.8%)，而在13例癌旁肺组织扩增产物中未显示异常，见图2。5例检出突变的标本均为有淋巴结转移的肺癌。NSCLC组织中FADD基因突变与肺癌的组织学类型、T分期均无显著相关，但与淋巴结转移呈显著相关，N分期越高者，发生FADD基因突变概率越高，进一步行Spearman相关分析显示两者呈显著正相关（rs=0.320，P<0.01），见表2。
图1 FADD基因第一外显子PCR扩增部分结果（略）
M：对照物（100～1 000bp）；T1～2：肺癌组织；N：癌旁非癌肺组织
图2 SSCP示FADD基因第一外显子突变（略）
M：对照物（100～1 000bp）；T1～2：肺癌组织；N：癌旁非癌肺组织
表2 FADD基因突变与肺癌临床特征的关系（略）
* 采用确切概率法
3 讨论
FADD基因由Kim等[8]1996年克隆定位于人染色体11q13.3，包含两个外显子和一个内含子。其中，FADD基因外显子2编码C端的死亡结构域（death domain, DD），是与Fas和肿瘤坏死因子受体 1( tumor necrosis factor receptor1，TNFR1)等细胞死亡受体的死亡结构域同源的结构域。而外显子1编码N端的死亡效应结构域（death effect domain，DED），该结构域的寡聚化，足以引起凋亡的发生，是诱导细胞凋亡发生的活性部位[9]。研究证实FADD是多种细胞死亡受体介导的凋亡信号传导途径中重要的转接蛋白（adapter）[3?5]，目前研究最为透彻的一条路径可以简单地表示为 Fas?FADD?caspase8途径，FADD在其中起着承上启下的关键作用。
FADD基因所在区域的杂合性缺失为NSCLC发生中重要的频发事件[10]，正如Fas基因所在10q23?24区域的杂合性缺失亦为NSCLC的频发分子事件，此外Fas基因的突变已在包括NSCLC的多种肿瘤组织中检见[6，11]，但有关FADD的突变研究报道尚为少见。Fas介导的凋亡信号通路是诱发组织细胞凋亡的重要途径。然而，Fas虽广泛表达于正常和肿瘤组织细胞中，但是其表达并不一定能介导凋亡发生[12]，提示了抑制Fas介导凋亡机制的存在，其中包括参与Fas介导凋亡通路中相关基因的突变。
本次研究中，我们检测NSCLC和癌旁正常肺组织中FADD基因编码DED区的第一外显子的突变情况，74例NSCLC中检出5例突变（6.8％），而13例癌旁正常肺组织无一例突变。我们检测所得到的突变情况与Shin等[6]首次报道的FADD基因在NSCLC中的突变情况极为接近，再次证实了NSCLC中存在FADD基因突变，这将为进一步揭示NSCLC凋亡调控机制提供新的线索。且值得注意的是所有检见FADD基因突变的癌组织均为伴有淋巴结转移的病例，统计分析显示FADD基因突变与淋巴结转移之间存在正相关关系，N分期越高者，发生FADD基因突变的概率越高，提示FADD基因突变在NSCLC淋巴结转移中可能起重要作用。肺癌的转移作为一个复杂的病理生理过程，包括从原发灶脱离、侵入淋巴管或血管、转移到另一部位或器官并继续增殖生长，无处不受到机体免疫系统的监视和打击；无一不是机体与肿瘤细胞对抗的结果。以往的研究产生这样的推测：肿瘤细胞要得以存活，离不开一个强有力的凋亡抑制机制，肺癌细胞在侵袭或转移过程中可能会存在凋亡基因的改变及表达异常，并导致凋亡水平的降低，从而避免机体自稳态机制对变异细胞的清除，完成肿瘤细胞的转移，这可能是肺癌细胞本身在转移过程中形成的一种“凋亡逃逸”现象[2]。我们的研究在一定程度上证实了这一假设。
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