siRNA对SGC7901/VCR细胞mdr1基因沉默效果的影响因素分析
【摘要】 目的 分析siRNA沉默人胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1基因效果的相关因素。方法 设计并体外转录合成4条靶向mdr1的siRNA(mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞，用RT?PCR和免疫印迹检测mdr1mRNA和P?gp的表达、流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性，综合这4方面结果评价4条siRNA的沉默效果情况；用分子生物学软分析siRNA沉默效果的影响因素。结果 沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列编码P?gp的跨膜区而且自身无茎和袢；沉默效果较差的mdr1si3071和最差的mdr1si1513 靶序列编码P?gp的胞内区，前者自身成茎和成袢。沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列在靶位点和靶位点外间有较少的碱基配对和氢键。siRNA的沉默效果与siRNA 3’5’端3个碱基中的A/U数量、N1和N19、GC含量间无可循。结论 siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果与靶序列的结构关系密切。
【关键词】 小分子干扰RNA mdr1基因 SGC7901/VCR细胞 基因沉默效果 siRNA设计
0 引言
众多研究表明，靶向同一基因mRNA不同靶点的siRNA，封闭基因表达的效果明显不同[1?3]，判断不同靶点的siRNA沉默基因效果的手段是实验。本研究设计了以mdr1为靶标的4条siRNA，从其对人胃癌多药耐药SGC7901/VCR细胞mdr1的mRNA、P?gp表达、P?gp功能和对阿霉素耐药性逆转角度，综合评定各条siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果，用分子生物学软件分析沉默效果的影响因素，以助于选择引发高效RNAi的siRNA靶序列。
1 材料和方法
1.1 siRNA的设计和合成
按Tuschl等的siRNA靶序列设计原则[4]，对GenBank中最新的mdr1 cDNA全长序列（登录号NM_000927.3）设计并选定潜在靶点16个；结合潜在靶点的位置和结构等因素，选准4个靶序列，用T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)，体外转录合成siRNA，分别为mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071。
1.2 siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1效果的检测
培养人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞（第四军医大学西京消化病研究所樊代明教授惠赠）和其亲本SGC7901细胞（本研究室保存）于含10%灭活小牛血清的RPMI1640、37℃、5％CO2中。SGC7901/VCR的培养液中加入VCR0.5～1.0μg/ml，以维持其耐药表型，在实验前撤除VCR 2周。用CodeBreakerTMsiRNA 转染试剂（Promega），分别将siRNA以20nmol的终浓度转染SGC7901/VCR细胞， 48h或72h后收获细胞进行检测，实验重复3次。数据以±s表示，用SPSS11.5进行统计学分析，组间比较采用配对t检验和方差分析，率的比较用行×列表的χ2检验，水准α=0.05。实验分7组，(1)对照组：SGC7901/VCR细胞，PBS；(2)转染试剂组：转染试剂+PBS；(3)mdr1si326组：转染试剂+mdr1si326；(4)mdr1si1513组：mdr1si1513；(5)mdr1si2631组：mdr1si2631；(6)mdr1si3071组：mdr1si3071；(7)SGC7901组：SGC7901细胞，PBS。检测项目如下：
1.2.1 RT?PCR 用TRIzol试剂（Gibco BRL产品）按说明书提取转染24h后的细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的纯度和浓度，电泳判定RNA的完整性。取总RNA4.2μg，用上海生物工程公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。用PRIME5.0设计mdr1（NM_000927）和β?肌动蛋白(β?actin，NM_001101)引物，由上海生物工程公司合成。mdr1引物上游序列为5′?tgactaccaggctcgccaatgat?3′，下游为5′?tgtgccaccaagtaggctccaaa?3′，扩增片段跨越3个内含子，产物457bp。β?actin引物上游序列为5′?tcctgtggcatccacgaaact?3′，下游为5′?gaagcatttgcggtggacgat?3′，产物314bp。取5μl cDNA，用上海生物工程公司的PCR扩增试剂盒进行PCR，体系25μl。目的和内参引物同时加入，同管扩增。以pUC19 DNA/MspⅠ作参照，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以mdr1和β?actin的比值进行mdr1基因mRNA表达水平的半定量分析。
1.2.2 免疫印迹 用TRIzol试剂（Gibco BRL产品）按说明书，从分离RNA、沉淀DNA后的有机相提取蛋白质，用考马斯亮蓝G?250标准曲线法测定其浓度。以每泳道50μg总蛋白，进行7.5％SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳。按预染蛋白分子量标志物标记，切取分子量在120～215kDa和36～47kDa之间的凝胶，用水浴式电转移将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。0.3%Triton X?100的TBS复性蛋白质，5%脱脂奶粉封闭；转移上120～215kDa之间蛋白的硝酸纤维素膜，依次和兔抗人P?gp（MDR1）多克隆抗体(Santa Cruz产品，1∶100)、羊抗兔生物素标记抗体(1∶200)和SABC(1∶200)孵育；转移上36～47kDa之间蛋白的膜，依次和actin Ab?5(NeoMarkers产品，1∶400)、羊抗鼠HRP标记抗体(1∶2 000)，DAB显色。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞内阿霉素蓄积 常规消化收取转染siRNA 48h细胞，调节细胞密度为（1～2）×105／ml，在6孔板培养24h。加入阿霉素使终浓度达10μg/ml，作用90min后收获细胞。4℃PBS洗涤细胞，75%乙醇固定，重悬于冷PBS 中，上样行流式细胞仪检测，接收波段为FL2（564～606nm）。每样本检测１×104个细胞。不加阿霉素作为空白对照，进行3次独立实验，每次3复孔。
1.2.4 MTT法检测阿霉素敏感性 收获转染siRNA 48h的细胞，按每孔2×104铺入96孔培养板，培养24h后，加入不同浓度的阿霉素（ADR），继续培养48h，按常规方法依次加入MTT、二甲基亚砜，在酶标仪上测定各孔的吸光度A492。每种药物浓度接种3复孔，设立只加PBS的细胞对照和无细胞的试剂对照。用对照组和药物组A492分别减去试剂组A492，得出校正对照组和药物组A492，存活率（存活率=校正药物组A492 / 校正对照组A492）。用Origin7.0软件，绘制剂量生存曲线，求出肿瘤细胞对ADR的半数抑制浓度（IC50）。按以下公式计算相对逆转效率：相对逆转效率=( IC50A?IC50B)/(IC50A?IC50C)，其中IC50A是SGC7901/VCR细胞的IC50，IC50B是转染siRNA或转染试剂的SGC7901/VCR细胞的IC50，IC50C是SGC7901细胞的IC50。
1.3 siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1效果的影响因素的获取
在GenBank用Blast Research软件，对mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071进行全基因组比对和序列同源分析，获取mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071靶序列位置。用DNASIS软件，预测mdr1 cDNA的二级结构，查出靶位点自身成茎成袢、和靶位点外碱基配对数及氢键数。用Ambion公司的siRNA设计程序，获取siRNA的正义链5′和3′末端碱基的种类和GC含量等。
2 结果
2.1 siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果
SGC7901/VCR细胞转染siRNA 48 h后，mdr1基因mRNA表达均下降（P<0.05），均未达到亲本SGC7901细胞水平，见图1，mdr1si326组下降58%、mdr1si2631组下降51%，二者差别不大（P>0.05）；mdr1si1513组下降26%、mdr1si3071组下降36%，二者差别也不大（P>0.05），mdr1si326或mdr1si2631组和mdr1si1513或mdr1si3071组间差别较大（P<0.05）。72h后，免疫印迹显示，见图1，P?gp的表达减少，以mdr1si326组的变动最明显。
图1 siRNA对胃癌耐药细胞mdr1 mRNA和P?gp的影响（略）
泳道1为对照组；泳道2为转染试剂组；泳道3、4、5和6分别为mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071组；泳道7为SGC7901组；M为Marker
SGC7901/VCR细胞转染 siRNA 48h后，见表1，细胞内阿霉素荧光阳性率明显增加，各组间的差异均有统计学意义（P<0.05）；阿霉素特异性荧光强度增强（P<0.05），除mdr1si1513和mdr1si3071组间外，mdr1si326组与mdr1si2631组之间、mdr1si2631组与mdr1si1513或mdr1si3071组间的差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞对阿霉素的IC50减少（P<0.05），mdr1si2631组明显低于mdr1si326组（P<0.05），mdr1si326组也低于mdr1si3071组（P<0.05）。相对逆转率增加，mdr1si2631组最高，mdr1si326组其次（P<0.05），mdr1si1513组和mdr1si3071组的差别无统计学意义（P>0.05）。
4条siRNA均能不同程度逆转SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药，综合组间差别进行统计学处理下的mRNA、P?gp表达水平及P?gp功能和对阿霉素耐药逆转程度的结果，得出：mdr1si326沉默SGC7901/VCR细胞mdr1效果最好，mdr1si2631其次，mdr1si3071较差，mdr1si1513最差。
2.2 siRNA沉默mdr1效果和沉默效果影响因素的关系
siRNA沉默SGC7901/VCR细胞 mdr1的效果和靶位点在mdr1cDNA序列的次序性，见表2。覆盖外显子的数量、同源性大小及编码P?gp的功能位点之间无可循，沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶位点均编码P?gp的跨膜区，而沉默效果较差的mdr1si3071和最差的mdr1si1513 靶位点均编码P?gp的胞内区，见表3。
siRNA沉默效果较差的mdr1si3071有自身成茎和成袢。在自身无茎和袢的mdr1si326、mdr1si1513和mdr1si2631靶位点中，沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631的靶位点和靶位点外碱基配对和氢键的数较少，沉默效果较差的mdr1si1513的靶位点和靶位点外碱基配对和氢键的数较多，见表4。
siRNA的mdr1沉默效果与3′，5′端3个碱基中的A/U数量差异、N1和N19的差异、GC含量间无规律可循，见表5。
表1 siRNA转染后细胞内阿霉素蓄积和细胞对阿霉素敏感性的变动（略）
注：*和对照组比较，P<0.05; #和SGC7901组比较，P<0.05
表2 siRNA的靶序列及其mdr1 mRNA位置和沉默效应（略）
表3 siRNA靶点和外显子、同源性及编码PK?gp的关系与其沉默效应（略）
表4 siRNA靶点的结构和沉默效应（略）
表5 合成siRNA的序列和3′，5′端特征与其沉默效应（略）
3 讨论
mdr1为最早认识的、人类mdr基因家族中唯一有功能的耐药基因，P?gp为药物外排泵，参与肿瘤的多药耐药。P?gp跨细胞膜分布，分为胞内3段和跨膜疏水区2个，跨膜疏水区有11个药物结合位点，第2、3胞内段各包含2个ATP结合位点[5，6]。siRNA是哺乳动物细胞RNAi的触发者[7]，选择沉默效果好的siRNA对进行哺乳动物细胞RNAi的研究十分重要。由于mdr1基因经转录、剪切形成mRNA的读码框长达3 840bp，符合Tuschl[4]等的设计原则的mdr1 cDNA位点有16条；同一基因mRNA的不同靶点，封闭基因表达的效果明显不同[1?3]，这使选定靶向mdr1的siRNA靶序列十分困难。为使设计的siRNA具有明显的沉默mdr1效果，本研究结合靶点的位置和结构等因素，选准4个靶点，实验证实靶向它们的siRNA均能封闭mdr1的表达，但封闭效果有别。这种位置效应可能和蛋白因子的竞争结合、热动力学稳定性和序列依赖的RNA诱导沉默复合物形成等因素有关[8]。本研究中，选择的靶点位于始密码325bp后，避免了转录因子等的竞争结合；在考虑到其他位置因素中，siRNA沉默SGC7901/VCR细胞 mdr1效果和靶位点在mdr1cDNA序列的次序性、覆盖外显子的数量、同源性大小及编码蛋白质的功能位点之间无规律可循；靶向编码P?gp的跨膜区位点的siRNA较编码P?gp的胞内区的效果好。mdr1cDNA序列的次序性方面和Celius等[9]的研究结果一致，靶向编码P?gp的分布部位方面和Celius的有异，Celius等用靶向mdr1基因mRNA的4条siRNA，转染人大肠癌耐药Caco?2细胞，筛选出2条高效的siRNA，其序列靶向编码P?gp的第1跨膜区和第3胞内区。提示靶向mdr1siRNA沉默基因效果和靶向编码P?gp的分布部位之间有无关系，有待进一步研究。
用DNASIS软件预测二级结构，mdr1cDNA的读码区广泛存在成茎和成袢现象，查找对比选准的4条靶序列，发现他们为成茎、成袢数量尽可能少和成茎尽可能短的部位。本研究显示，siRNA沉默SGC7901/VCR细胞 mdr1的效果和靶位点的结构有关，靶序列自身成茎和成袢者，沉默效果较差；靶序列和靶序列外碱基配对多者，形成氢键的数量多者，沉默效果也差，和Schubert、Luo、Overhoff[10?12]的研究相符。
有研究认为siRNA正义链5′和 3′末端3bp中的A/U含量和功能相关，有功能的序列3′末端3bp中的A/U含量高于5′末端，U1和G19序列常常没有功能，G/C1和U/A19和功能相关[13?15]。本研究中，4条siRNA的3′末端3bp中的A/U含量高于5′末端，AA后没有一条为U1和G19序列，和他人研究一致，但siRNA沉默效果和3′5′端3个碱基中的A/U数量差异、G/C1和U/A19序列无一致性，有待进一步探讨。siRNA的GC含量和功能密切相关，主要参与双链的解旋、靶向识别和杂交等过程[16]，本实验证实有沉默效果的4条siRNA中，GC含量在42.9%～47.6%之间，GC含量和沉默效果之间无规可循，和筛选中严格限制了GC含量有关，相似于Amarzguioui等[13]的研究结果。
本研究提示：在siRNA靶序列设计和选择中，除了遵守Tuschl等的设计原则外，还应考虑靶序列的位置、靶序列结构、siRNA的正义链5′和3′末端碱基的种类，尤其是靶序列结构，尽可能选择自身无成茎和成袢现象、靶序列和靶序列外碱基配对和氢键的数量最少的部位。
【】
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