乙酰肝素酶的表达与肝癌侵袭转移及预后的关系

【摘要】  目的 探讨乙酰肝素酶（Heparanase Hpa）在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法 分别采用RT?PCR和免疫组织化学法检测Hpa mRNA及Hpa蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达。结果 肝癌Hpa mRNA的表达显著高于癌旁及正常肝组织（P< 0.05），肝癌组织中Hpa mRNA的表达与肿瘤包膜受侵、门脉受侵、肝内转移、TNM分期、复发有关（P<0.05）。肝癌Hpa蛋白的表达与包膜和门脉是否受侵、Edmondson分级、有无肝内转移、TNM分期及复发有关（P<0.05）。结论 Hpa mRNA及蛋白在肝癌中高表达，并与肝癌的侵袭转移、复发、预后有关。

【关键词】  肝细胞肝癌 乙酰肝素酶 侵袭 转移 复发

　　0  引言
   
　　乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是1999年克隆分离出的一种葡糖苷酸内切酶[1]。它可以降解硫酸乙酰肝素 (hearan sulfate，HS)，破坏细胞外基质和血管基底膜，并促进肿瘤新生血管生成，使肿瘤细胞实现侵袭转移。我们运用RT-PCR和免疫组织化学法对Hpa mRNA及Hpa蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达进行了检测，探讨其与肝癌临床病理特征及预后的关系。

1  资料与方法

　　1.1  一般资料
   
　　43例肝癌和癌旁标本来自我院2001年1月～2002年6月手术切除并经病理证实的肝细胞肝癌患者，癌旁组织为距肿瘤2cm处肝组织。另取手术的良性疾病的正常肝组织10例作对照。标本切除离体后一份立即投入液氮中，置于-70℃冰箱保存备用，另一份用10％的福尔马林固定。病人随访2年以上，其中23例复发，1例死于其他疾病。本组病例男性36例，女性7例。年龄36～72岁，平均52.7岁；HBsAg阳性者37例。病分级根据Edmondson方法，分期按国际抗癌联盟于1997年提出的TNM分期方案。

　　1.2  主要试剂
   
　　Trizol试剂（美国Gibco BRL公司），DNTPs、AMV、TaqDNA 聚合酶由华美公司提供，内参照及随机引物由上海生工生物工程公司合成。Hpa兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。人肝细胞癌细胞株SMMC?7721细胞、BEL?7402细胞由院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

　　1.3  细胞培养方法
   
　　用RPMI?1640培养基在含有5％ CO2、37℃恒温培养箱中分别培养人肝细胞癌细胞株SMMC?7721和BEL?7402细胞，常规传代，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，离心10min（1 000r/min），10mol/L PBS洗细胞两次后，收集细胞用于提取总RNA。

　　1.4  总RNA提取
   
　　参照Trizol试剂说明书提取组织及细胞总RNA，然后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶移至紫外透射仪下，在300nm紫外光线照射下进行观察，验证RNA的完整性，并在紫外分光光度仪上测260nm和280nm两个波长的吸光度，进行RNA的定量。

　　1.5  半定量RT?PCR检测
   
　　Hpa引物序列上游为5'?TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC?3'，下游为5'?GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC?3'，其扩增片段长度为585bp。以β?actin作为内参照，其引物序列上游为5'?ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG?3'下游为5'?CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC?3'，其扩增片段长度为838bp。Hpa的反应条件为反转录37℃ 60min；预变性94℃ 5min；变性94℃ 1min；复性57℃ 1min；延伸72℃ 1min。进行35个循环后进一步延伸72℃ 5min。取10μl产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶扫描仪（美国FOTODYNE公司）进行cDNA电泳条带和光量子强度分析，将Hpa与β?actin比值作为Hpa表达水平的参数。

　　1.6  免疫组织化学染色方法及结果判定
       
　　标本常规甲醛固定取材、脱水、石蜡包埋后做4μm连续切片，按SP免疫组织化学染色试剂盒染色步骤进行，Hpa表达阳性为细胞浆染成棕黄色，在光镜下观察5个高倍视野，阳性细胞数，阳性细胞数≤10％为阴性表达，>10％为阳性表达。

　　1.7  统计学处理
   
　　采用t检验及χ2检验，由SPSS10.0软件进行处理。

　　2  结果

　　2.1  Hpa在不同组织中的表达
   
　　43例肝癌组织中有26例（60.5%）Hpa mRNA阳性表达，43例癌旁组织中仅2例（4.7%）阳性表达；免疫组织化学染色显示25例肝癌组织Hpa 蛋白表达阳性，癌旁组织有5例表达阳性；10例正常肝组织均未见表达；肝癌与癌旁、正常肝组织的Hpa mRNA及蛋白表达差异有显著性（P<0.05）；人肝癌细胞株SMMC?7721及BEL?7402细胞Hpa mRNA及蛋白均呈阳性表达，见图1～3。

　　T1～T2，SMMC?7721 cell; T3～T4，BEL?7402 cell; T5～T7，HCCS; N: adjacent tissnes of HCC; β?actin expression: 1～8; M: Marker

　　图1  HPa mRNA表达的RT?PCR结果（略）
 
　　2.2  Hpa表达与临床病理特征的关系

　　表1  Hpa mRNA和蛋白的表达与肝癌临床病理特征的关系（略）

　　2.3  Hpa mRNA表达与预后的关系
   
　　将本组病人分为两组，一组Hpa 高表达（Hpa mRNA表达阳性，Hpa／actin值≥0.5），另一组为低表达（Hpa mRNA表达阴性，Hpa／actin值<0.5）。其中高表达组复发率（73.9％）显著高于低表达组（30%）（P<0.05）。Hpa mRNA高表达组的平均无瘤生存时间（15.88月）显著低于低表达组（28.88月，P<0.05）。Hpa阳性表达组的复发率显著高于阴性表达组，Hpa阳性表达组的无瘤生存时间（14.98月）显著低于阴性表达组（28.34月，P<0.05）。

　　3  讨论
   
　　在生理状态下，Hpa主要分布在胎盘、脾脏、血小板以及中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞内，在肝脏、肾脏及胰腺等均不表达。研究发现Hpa在结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌等[2,3]多种恶性肿瘤细胞中异常高表达，而相应的正常组织不表达。本实验结果显示，肝癌组织Hpa mRNA及Hpa蛋白的表达显著高于癌旁肝组织及正常肝组织（P<0.05），正常肝组织不表达，与报道一致。EI?Assal等[4]运用RT?PCR研究显示47％的肝癌组织Hpa mRNA表达阳性，癌旁组织不表达或微弱表达，正常肝组织不表达。说明Hpa的表达可能与肝细胞的恶性转化及肿瘤的演进有关。
   
　　HS是构成细胞外基质和基底膜的基本成分，起着维持基质结构稳定，限制细胞运动及粘附的作用，其降解破坏了基质及基底膜的完整性；同时，使基质中储存的大量生长因子如碱性成纤维因子和血管内皮生长因子释放，加速血管的形成。最终导致肿瘤的侵袭转移。Hulett等[5]发现高转移的鼠腺癌细胞系表达高水平Hpa mRNA，而低转移细胞系仅有少量表达。Gohji等[6]发现Hpa蛋白在肌层受侵、有淋巴结转移、临床分期高的膀胱癌组织表达显著升高，显示其与膀胱癌的侵袭转移有关。Vlodavsky等[7]研究也发现侵袭性乳腺癌比非侵袭组织有更高Hpa表达。本实验显示高侵袭性的人肝癌细胞株SMMC?7721及BEL?7402细胞Hpa mRNA及蛋白均呈阳性表达。在肝癌组织Hpa mRNA表达与包膜和门静脉有无受侵、有无肝内转移、TNM分期有关（Ρ<0.05）；Hpa蛋白的表达与包膜和门脉是否受侵、Edmondson分级、有无肝内转移及TNM分期有关（Ｐ<0.05，见表1）；两种实验方法结果基本一致。临床上肝癌包膜实际上是假包膜，只是肿瘤边界的标志，包膜受侵同门静脉受侵和肝内转移一样可以提示肿瘤的侵袭转移。因此，我们认为Hpa的表达与肿瘤的侵袭转移有关，是肿瘤侵袭转移的促进因素。人们常将肿瘤分化程度作为反映肿瘤生物学特性的客观指标，但是本实验Edmondson分级与Hpa mRNA表达水平无关（P＝0.069），免疫组织化学检测结果显示Hpa蛋白的表达与Edmondson分级有关，有待于进一步的研究。另外，本研究表明肿瘤大小与Hpa的表达无关。我们认为肿瘤大小只能反映肿瘤自身的生长情况，与肿瘤侵袭性并不一致，不能预示肿瘤的复发与转移。但也有相反的报道，EI?Assal等[4]认为Hpa的表达与肿瘤的大小有关。
   
　　文献报道Hpa的表达还与恶性肿瘤的预后有关，Mikami等[8]应用免疫组化技术研究Hpa蛋白在食管癌组织中的表达情况，发现Hpa表达阳性的食管癌病人预后较差。Koliopanos等[9]应用半定量RT?PCR及Western等方法研究发现Hpa高表达的病人术后存活时间显著短于低表达的病人。根据我们的随访资料，Hpa mRNA高表达组术后2年的复发率为73.9％，显著高于低表达组的30％（Ｐ<0.05），Hpa mRNA高表达组的平均无瘤生存时间为15.88月,显著短于Hpa mRNA低表达组的28.88月（Ｐ<0.05）。免疫组织化学检测结果也得出同样结论。说明Hpa高表达，加大了肿瘤的侵袭、转移和复发的风险,与文献报道一致。
   
　　总之，本研究结果表明，Hpa mRNA及蛋白的表达与肝癌的侵袭、转移、复发有关，可以作为判断预后、预测复发及指导术后的指标，并有望成为肝癌治疗的新靶点。

　　（本文图2、3见第136页）（略）

【文献】
  　　［1］ Vlodavsky I, Firedmann Y, Elkin M, et al. Mammalian hepa?ranase: gene cloning, expression and function in tumor progession and metastasis[J]. Nat Med, 1999, 5(7):793?802.

　　［２］ Firedmann Y, Vlodavsky I,Aingorn H, et al. Expression of heparanase in normal, dysplastic and neoplastic human colon mucosa and stoma[J]. Am J Pathol,2001, 157(4):1167?1175.

　　［３］ Ginath S Menczer J, Friedmann Y,et al.Expression of heparanase, Mdm2, and erbB2 in ovarian cancer[J]. Int J Oncol, 2001,18(6):1133?1144.

　　［４］ EI?Assal ON, Yamanoi A, Ono T, et al. The clincopathological significance of heparanase and basic fibroblast growth factor expressions in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2001,7(5): 1299?1305.

　　［５］ Hulett MD, Freeman C, Hamdorf BJ, et al. Cloning of mammalian heparanasr, an important enzyme in tumor invasion and mestastasis[J]. Nat Med, 1999, 5(7): 803?809.

　　［６］ Gohji K, Katsuoka Y, Okamoto M, et al. Human heparanase: roles in invasion and metastasis of cancer[J]. Hinyokika Kiyo, 2000,46(10):757?762.

　　［７］ Vlodavsky I, Elkin M, Pappo O, et al. Mammalian heparanase as mediator of tumor metastasis and angiogenesis[J]. Isr Med Assoc J, 2000,2(Suppl)：37?45.

　　［８］ Mikami S, Ohashi K, Usui Y, et al. Loss of syndecan?1 and increased expression of heparanase in invasive esophageal carcinomas[J]. Jpn Cancer Res, 2001,92(10): 1062?1073.

　　［９］ Alexander Koliopanos, Helmut Friess, J rg Kleeff, et al. He?paranase Expression in Primary and Metastatic Pancreatic Cancer[J]. Cancer Research, 2001, 61(12): 4655?4659.