DAPK对IFN?γ抑制PGCl3细胞恶性表型的影响

【摘要】  目的 探讨肿瘤转移抑制基因DAPK对IFN?γ抑制高转移肺癌PGCl3细胞株运动、侵袭、黏附、克隆形成率的影响。方法 用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3.1,将抑癌基因DAPK转入高转移肺癌PGCl3细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆。观察DAPK增强INF?γ抑制PGCl3细胞增殖、运动、侵袭、黏附、克隆形成率。结果 DAPK基因转染的PGCl3细胞对INF?γ敏感。IFN?γ抑制转染DAPK基因的PGCl3细胞的增殖、侵袭能力、运动能力、黏附能力、克隆形成率，而且IFN?γ的影响呈剂量依赖性。结论 肿瘤转移抑制基因DAPK增强INF?γ抑制PGCl3细胞的恶性表型。

【关键词】  死亡相关蛋白激酶 转移 肺癌

　　0  引言
   
　　死亡相关蛋白激酶（death associated protein kinase,DAPK）是一类新的钙离子/钙调素依赖激酶，使其底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，该激酶最初是作为γ干扰素（IFN?γ）诱导细胞凋亡的一种正调控子被分离鉴定[1]。研究表明，许多肿瘤细胞中DAPK是失活的，过表达的DAPK抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，DAPK是一个潜在的肿瘤抑制基因和抑制肿瘤转移的基因[2?4]。本研究将DAPK基因导入高转移人肺癌细胞株（PGCl3细胞株）,观察IFN?γ对过表达DAPK的肺癌细胞生物学行为的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
   
　　PGCl3细胞株(广东医学院生化教研室提供)以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5% CO2中培养; pcDNA3.1?DAPK质粒[5]（张海涛博士赠送）。四甲基偶氮唑蓝(MTT), Aprotinin，Leupeptin，PMSF，抗人DAPK单克隆抗体(clone?55,sigma公司); LipofectAMINE2000 Reagent (invitrogen公司); IFN?γ，RPMI1640(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);Costar? Transwell(Cat3422,Lot#17502017),?8μm,Corning公司),Matrigel, Fibronectin(BD公司),氯仿, 异丙醇(国产分析纯),western blotting luminol reagent(北京中山)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞转染 
   
　　以pcDNA3.1?DAPK与pcDNA3.1分别转染PGCl3细胞。参照lipofectamine2000说明书,将细胞接种于24孔板，含10%的小牛血清的RPMI1640培养液5% CO2培养。用无血清的DMEM培养液漂洗细胞3次。含0.8μg的质粒溶液与无血清DMEM培养液混合终体积为50μl；2.0μl的lipofectamine2000与48μl无血清DMEM培养液混合终体积为50μl。室温孵育5min，将稀释的DNA与质脂体混合，继续孵育20min。将100μl混合好的DNA与质脂体溶液滴到细胞表面，来回混匀，培养24h后，胰酶消化细胞，加不含抗生素的培养基按1∶6稀释细胞，接种，继续培养24h，加入含1mg/ml的G418培养液进行抗性筛选，每3～5天弃掉死细胞，更换培养液。2～3周可见有克隆形成，换含500μg/ml G418培养液维持培养。挑取克隆进行扩增培养，免疫印迹检测DAPK基因表达。免疫印迹方法参照《分子克隆实验指南》第2版。

　　1.2.2  DAPK基因对PGCl3细胞生长的影响 
   
　　收集转染组及对照组PGCl3细胞,分别用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养,调整细胞浓度至2×105/ml,用96孔培养板(每孔加入100μl细胞悬液)37℃、5% CO2孵箱中培养, 加不同浓度的IFN?γ处理，用MTT法测细胞生长。记录各组细胞的吸光值,作图,每组重复4次,取平均值。

　　1.2.3  集落形成实验
   
　　参照提供的方法[6]，加不同浓度的IFN?γ处理各组细胞。

　　1.2.4  侵袭实验 
   
　　采用Corning公司生产的研究侵袭运动用的Costar? Transwell培养板,参照说明书,上室铺Matrigel 50μl(200μg/ml),下室加入含10μg/ml Fibronectin的10%血清的培养基600μl。收集各组PGCl3细胞1×106/ml,取100μl,加入已铺有Matrigel的孔内, 加不同浓度的IFN?γ处理。置37℃、 5%  CO2孵箱培养24h后取出多聚碳酸酯膜,擦去膜上未穿过的细胞,将膜用甲醇/丙酮固定10min后HE染色,透明液透明,光镜下计数穿膜细胞数。
   
　　侵袭百分率=实验组侵袭细胞数/空白对照组细胞数×100%,每组重复4次,取平均值。

　　1.2.5  运动实验
   
　　除不涂布Matrigel膜外,其余操作步骤及计数方法同侵袭实验。
   
　　运动能力=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%。每组重复4次,取平均值。

　　1.2.6  粘附实验 
   
　　取96孔培养板,每孔加入Matrigel 20μg,冷冻干燥,置37℃,5%  CO2孵箱孵育1h,PBS洗2次,再加入2%牛血清白蛋白0.2ml,孵育2h,PBS洗2次,包被备用。收集各组PGCl3细胞,用含1%牛血清白蛋白的RPMI1640液调整细胞为2×105/ml,将细胞悬液分别接种于已包被的培养板内0.1ml/孔, 同时加不同浓度的IFN?γ处理，于37℃保温60min后,弃去未粘着细胞,用PBS液轻洗2遍,经0.25%胰酶消化后收集粘附细胞计数。
   
　　粘附百分率=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%。每组重复4次,取平均值。

　　1.2.7  统计学处理
   
　　实验数据采用多重t检验对各组数据进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  DAPK表达检测
   
　　图1a是免疫印迹检测结果,转染的PGCl3细胞有DAPK表达显色条带,而pcDNA3.1转染组和空白组在可检测限内均无DAPK表达;图1b是各组细胞的β?actin对照。
 
　　1.pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞；2.pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞；3. 未转染的PGCl3细胞

　　图1  DAPK表达检测（略）
 
　　2.2  IFN?γ对转染PGCl3细胞生长的影响
   
　　如图2所示。转染DAPK基因的PGCl3细胞对IFN?γ更加敏感,而且IFN?γ的影响呈剂量依赖性。
 
　　pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞与pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞比较(* P<0.05;** P<0.01.t-test, n=4)

　　图2  IFN?γ对PGCl3细胞活性的影响（略）
 
　　2.3  IFN?γ对转染PGCl3细胞侵袭，运动，黏附能力的影响
   
　　如图3～5所示。IFN?γ抑制转染DAPK基因的PGCl3细胞的侵袭能力,运动能力，粘附能力，而且IFN?γ的影响呈剂量依赖性。
 
　　pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞与pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞比较(* P<0.05;** P<0.01.t-test, n=4)

　　图3  IFN?γ对PGCl3细胞侵袭能力的影响（略）
 
　　pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞与pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞比较(* P<0.05;** P<0.01.t-test, n=4)

　　图4  IFN?γ对转染PG细胞运动能力的影响（略）
 
　　pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞与pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞比较(* P<0.05;** P<0.01.t-test, n=4)

　　图5  IFN?γ对转染PG细胞黏附能力的影响（略）
 
　　2.4  IFN?γ对转染PGCl3细胞克隆形成能力的影响
   
　　如图6所示。IFN?γ抑制转染DAPK基因的PGCl3细胞的克隆形成能力，而且IFN?γ的影响呈剂量依赖性。
 
　　pcDNA3.1载体转染的PGCl3细胞与pcDNA3.1?DAPK转染的PGCl3细胞比较(* P<0.05;** P<0.01.t-test, n=4)

　　图6  IFN?γ对转染PGCl3细胞克隆形成能力的影响（略）
 
　　3  讨论
   
　　研究表明，DAPK在IFN?γ、Fas、TNF?α[1?3]和细胞外介质剥离造成的死亡起着调节作用[4]，提示它与各种因素引起的细胞凋亡有着广泛联系。
   
　　Divine等[7]和Tang等[8]发现44%的非小细胞肺癌存在DAPK基因启动子高甲基化。非小细胞肺癌预后低的存活率与DAPK基因高甲基化有密切联系。DAPK高甲基化是预言非小细胞肺癌病人存活率的独立影响因子[3]。Simpson等[9]研究发现DAPK的失活与垂体瘤的侵袭性有相关性。国内张海涛等实验也证实，转染DAPK基因可以诱导淋巴肿瘤细胞凋亡[5]。这些发现表明DAPK可以诱导细胞凋亡抑制肿瘤转移[3]。
   
　　恶性肿瘤对人体的致命危害主要在于肿瘤细胞向周围浸润以及向远处转移,而粘附、运动和侵袭能力是肿瘤细胞发生浸润、转移的关键环节。已知肿瘤细胞穿越基底膜的关键在于其运动能力[10],而决定细胞运动力的是由微管、微丝和中间丝等构成的细胞骨架蛋白。细胞中微管的聚合状态,改变细胞的粘附运动能力。有研究表明，DAPK能磷酸化MLC(myosin的轻链)[1，4]。这也许是它们抑制肿瘤细胞运动、侵袭、粘附能力的关键所在,因为MLC的磷酸化与细胞膜出现出泡变化，细胞形态变化过程是联系在一起的[11]。过表达的DAPK可能可以与细胞骨架系统相互作用抑制肿瘤细胞运动、侵袭、粘附能力。本实验结果也表明，IFN?γ抑制表达DAPK的高转移肺癌运动、侵袭、粘附能力。IFN?γ可能激活DAPK的活性，作用于细胞骨架系统抑制PGCl3的恶性表型。
   
　　另外，DAPK还可以通过改变整合素的构象影响细胞的附着性,抑制整合素的活性及整合素介导的细胞存活信号,同时激活p53介导的细胞凋亡信号,并干扰FAK激酶的功能,下调细胞的存活信号[12]。IFN?γ可以通过激活DAPK诱导肿瘤细胞凋亡，过表达的DAPK可以增强IFN?γ刺激细胞凋亡。我们的实验结果显示，IFN?γ抑制表达DAPK的PGCl3细胞克隆形成能力。
   
　　Fas?依赖途径可以通过激活DAPK诱导细胞凋亡，但有研究表明肺癌中Fas表达降低、凋亡细胞减少促进肿瘤的生长和转移[13]。而转染DAPK可以通过其他激活途径，或直接诱导细胞凋亡。
   
　　综合实验结果推断，转染DAPK基因的确可以增强IFN?γ抑制PGCl3的恶性表型。IFN?γ通过激活DAPK抑制PGCl3细胞的运动、侵袭、粘附能力。IFN?γ通过激活DAPK，诱导肿瘤细胞凋亡而抑制PGCl3细胞克隆形成能力。转染DAPK基因的PGCl3细胞对IFN?γ更敏感，表明DAPK基因具有作为一种基因的武器用于治疗非小细胞肺癌的潜在可能。

【】
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