Bmi?1基因及其编码蛋白在SKM?1细胞系中的表达
【摘要】 目的 探讨人类Blymphoma Mo?MLV insertion region（Bmi?1）基因及其编码蛋白在骨髓增生异常综合征（myelodysplasia syndrome，MDS）发病中的地位和作用。方法 以正常骨髓和白血病细胞系K562为对照，利用半定量RT?PCR和Western Blot研究MDS细胞系SKM?1中Bmi?1基因在mRNA和蛋白水平的改变。结果 SKM?1中Bmi?1在mRNA和蛋白水平均较正常组织有明显表达（P<0.05），二者表达水平与K562细胞系无显著差异（P>0.05）。结论 Bmi?1基因在MDS亚型RAEB细胞系SKM?1中有明显表达，其在RAEB发病中可能具有重要意义。
【关键词】 Bmi?1 MDS SKM?1
0 引言
Bmi?1是 Polycomb家族成员，其最初发现是作为一种原癌基因与另一种癌基因c?myc共同导致B细胞淋巴瘤的发病。近年来研究发现，该基因对于维持干细胞及肿瘤干细胞的自我更新，进而维持干细胞池的大小具有重要意义。骨髓增生异常综合征（MDS）是一种干细胞水平的恶性血液疾病，Bmi?1在MDS中的表达国内外尚无相关研究。我们通过研究Bmi?1在MDS细胞系SKM?1中的表达水平，初步探讨了Bmi?1在MDS发病中的作用，以期为进一步指导临床提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料
Bmi?1单克隆抗体（Santa Cruz产品），二抗（HRP标记羊抗鼠IgG,晶美），K562细胞系（本室保存），SKM?1细胞系（JCRB0118，Kawaguchi.R）,蛋白标准品（Sigama），ECL发光试剂盒、一步法RT?PCR试剂盒（晶美），BeyozolRNA抽提试剂盒、硝酸纤维素膜（展晨），Bmi?1,GAPDH引物均由上海生工合成，显影液、定影液（晶美）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
SKM?1、K562细胞系培养传代，每周半量换液，培养条件为含10%小牛血清的RPMI1640，37℃，5% CO2。
1.2.2 正常对照
取正常人骨髓，常规分离单个核细胞备用。
1.2.3 RT?PCR
（１）收集细胞：取对数生长期的细胞，按1×107浓度制备细胞悬液，1 000r/min离心3min，去上清，1×PBS洗涤沉淀1次;（２）提取RNA按Beoyozol试剂盒说明提取总RNA，取少量琼脂糖凝胶电泳测试RNA完整性;（３）一步法RT?PCR 按试剂盒说明进行。反应体系：5×buffer 10μl,25mmol/L MgCl2 2μl,dNTP各2μl，Taq酶2μl，模板1.5μl，p1、p2(5pmol/μl)各1μl，DEPC处理ddH2O水补足50μl，混匀，离心。反应条件：逆转录60℃ 30min;预变性95℃ 5min；变性95℃ 1min，退火54℃ 1min,延伸72℃ 1min，进行25个循环，最后72℃延伸10min。结束后，取产物5μl, 1%琼脂糖凝胶电泳（80V，10min），灰度扫描。
Bmi?1引物序列：p1: 5’?CTG GTTGCCCATTGACAGC?3’; p2: 5’?CAGAAAATGAATGCGAGCCA?3’,片段长度为70bp。
GAPDH引物序列：p3: 5’?CCATGGAGAAGGCTGGGG?3’; p4: 5’?CAAAGTTGTCATGGATGA CC?3’,片段长度为199bp。扩增条件见［1］。
1.2.4 Western Blot
常规提取蛋白， Bradford法蛋白定量， 蛋白电泳， 电转膜（80mA恒流电20h）， 0.01M PBS洗膜3次， 8%脱脂奶粉室温封闭2h， 加入一抗（1∶1 000）， 4℃过夜， 洗膜3次， 加入二抗（1∶1 000）, 37℃孵育1h， 洗膜3次， 按ECL发光试剂盒说明操作， 显影， 定影， 冲洗， 晾干， 灰度扫描。
1.2.5 统计学分析
KS400图像系统进行灰度分析，结果以±s表示，统计学处理采用one?way anova(SPSS10.0)。
2 结果
2.1 Bmi?1 mRNA在MDS细胞系SKM?1中的表达
Bmi?1 mRNA/GAPDH mRNA表达灰度比值（±s）在正常骨髓单个核细胞以及白血病细胞系K562，MDS细胞系SKM?1中分别为0.984±0.112，4.406±0.163，4.632±0.226，如图1显示Bmi?1 mRNA在SKM?1中有明显表达，而在正常组织中仅有少量表达，表达量经统计学处理有显著差异（P<0.05）。K562细胞系中Bmi?1 mRNA表达亦较明显，与SKM?1表达量经统计学处理无显著差异（P>0.05）。
图1 Bmi?1 mRNA在正常骨髓、K562以及MDS患者骨髓中的表达（略）
M为marker;1为正常骨髓单个核细胞；2为K562;3为SKM?1
2.2 Bmi?1蛋白在SKM?1中的表达
以正常人骨髓以及白血病细胞系K562为对照。图2显示在上样蛋白量基本一致的条件下，Bmi?1蛋白在SKM?1中有明显表达，而在正常组织中仅有少量表达，前者是后者的3.94倍。K562细胞系中Bmi?1蛋白表达亦较明显（3.01）。这一结果与Bmi?1 mRNA在SKM?1中的表达吻合。
图2 Bmi?1蛋白表达（略）
3 讨论
Bmi?1是人类基因组中小鼠Bmi?1基因的相似基因，二者在序列上有较强的同源性，事实上，关于人类Bmi?1基因的许多功能都是通过对小鼠Bmi?1基因的研究得到的。
早期研究表明，Bmi?1主要功能是作为一种原癌基因参与多种肿瘤的发生，如B细胞淋巴瘤，神经系统肿瘤等[1]。其发挥作用的途径是通过一种叫Bmi?1的信号通路控制下游人们所熟知的癌蛋白以及细胞周期调控蛋白，如c?myc、 pRB等的激活。近年来研究发现[2,3]，Bmi?1信号通路对于维持干细胞的自我更新，进而维持干细胞池大小的稳定具有重要意义。近年来兴起的肿瘤干细胞理论认为，肿瘤的行为学特征和干细胞非常相似，有可能肿瘤的发生是来源于肿瘤干细胞[4,5]。这种恶性的干细胞不同于一般的肿瘤细胞，因为它可以按严格的方式自我更新、自我复制，从而维持自身数量的恒定，而其子代肿瘤细胞则不具有这种能力。许多研究证明[6?9]，能够转化实验动物产生肿瘤的是一些具有干细胞标志的细胞，而干细胞相关基因在肿瘤的发生中具有重要地位。
MDS是一类干细胞水平的血液疾病，众多研究表明MDS是一类异质性很强的疾病，不同的MDS亚型，甚至属于同一亚型的不同病人，从发病机理到临床表现、预后都有很大不同，这给带来很大困难。另外，同其他类型肿瘤相比，MDS研究存在一个重要问题，即目前缺乏广泛认可的动物模型和细胞系，这严重阻碍了MDS研究进展[10]。
本项研究试图通过对MDS亚型RAEB细胞系SKM?1的研究，初步探讨Bmi?1在骨髓增生异常综合征发病中的地位和作用。我们的研究结果表明，Bmi?1 mRNA和Bmi?1蛋白在SKM?1细胞系中均较正常组织有显著表达，这表明Bmi?1可能在MDS亚型RAEB的发病中具有重要意义。
限于MDS细胞系的缺乏，我们的研究仅仅限于RAEB亚型MDS。至于Bmi?1在其他亚型MDS发病中的地位和作为，尚需进一步结合相关细胞系和临床研究的结果来证实。另外，Bmi?1信号通路的组成以及激活的始动因素尚不清楚，有待于进一步研究。
【】
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