转4?1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究

         作者：刘承利, 臧晓霞, 窦科峰, 朱帮福, 张洪义, 张宏义     

【摘要】  目的 研究转4?1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL?2、TNF?α和GM?CSF）的能力。方法 以丝裂霉素C（MMC）处理高表达转m4?1BBL基因的小鼠Hepa1?6肝癌细胞，制成肿瘤细胞瘤苗（TCV），体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后，观察其对脾细胞产生细胞因子（IL?2、TNF?α和GM?CSF）的影响。结果 TCV?4?1BBL刺激后，脾细胞体外分泌细胞因子IL?2、TNF?α和GM?CSF的水平明显增高。结论 转4?1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗能刺激脾细胞产生细胞因子IL?2、TNF?α和GM?CSF。

【关键词】  小鼠4?1BBL; 共刺激分子; 肿瘤疫苗; 肝细胞癌; 细胞因子

　　　Abstract：Objective   To study the cytokines production of spleen cells induced in vitro by murine 4?1BBL gene transfected Hepa1?6.Methods  Murine hepatocellular carcinoma cell line Hepa1?6?m4?1BBL which could highly express murine 4?1BBL was cultivated previously. The tumor cell vaccine (TCV?m4?1BBL) was obtained by treating Hepa1?6?m4?1BBL with mitomycin (MMC). Cocultivation TCV with syngeneic murine spleen cells and the supernatants were harvested for detecting the cytokines (IL?2,TNF?α  and   GM?CSF).Results  Comparing with TCV?Hepa1?6, high levels of IL?2,TNF?α  and  GM?CSF were released by the spleen cells after stimulated by TCV?m4?1BBL.Conclusion  Stimulation signals delivered by 4?BBL remarkably increased the production of IL?2,TNF?α  and  GM?CSF.

　　Key words：murine 4?1BBL; Costimulatory molecule; Tumor cell vaccine; Hepatocellular carcinoma; Cytokines

　　0  引言
   
　　机体对肿瘤的免疫主要靠细胞免疫，特别是T细胞免疫。而T细胞的激活除了MHC?抗原多肽复合物与T细胞受体（TCR）的结合所提供的第一信号外，共刺激分子（Costimulatory molecules）提供的第二信号也起着至关重要的作用 [1]。缺乏这些共刺激分子将导致T细胞进入克隆无能或凋亡。因此，将共刺激分子导入肿瘤细胞以制备肿瘤疫苗成为近来肿瘤生物的研究热点。我们在研究中发现将小鼠肝癌细胞Hepa1?6中导入4?1BBL基因能明显增强其体内诱导机体产生免疫应答的能力 [2]，本文应用上述基因工程瘤苗研究了其体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL?2、TNF?α和GM?CSF）的能力，以对其抗肿瘤机制作进一步的探讨。

　　1  材料及方法

　　1.1  材料 

　　小鼠肝癌细胞株Hepa1?6由上海第二军医大学国际合作肿瘤研究所郭亚军教授惠赠，转m4?1BBL基因的高表达细胞株Hepa1?6?m4?1BBL及转空载体的Hepa1?6?neo为作者建立［3］，DMEM培养基为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品。大鼠抗小鼠4?1BBL抗体（BD公司产品）购自深圳晶美公司，羊抗大鼠IgG?FITC、PHA?P、MTT、DMSO为Sigma公司产品。丝裂霉素C（MMC）为 Kyowa Hakko Kkgyo 公司产品。TRIzol试剂及superscript Ⅱ反转录试剂盒为Invitrogen公司产品。Taq酶为华美公司产品。C57BL/6小鼠购自第四军医大学实验动物中心，6周龄，雌性。淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心。放线菌素Ｄ（ACD）为Fluka公司产品。IL?2标准品、TNF?α标准品、GM?CSF标准品为第四军医大学生物技术中心及免疫教研室提供。L929细胞株、TF?1细胞株为第四军医大学免疫教研室提供。引物由上海生工生物工程公司合成，根据GeneBank中m4?1BBL基因全长序列设计上游引物P1：5’?GCGGATCCATGGACCAGCACACACTTGA?3，下游引物P2：5’?CGGATTCTCATTCCCATGGGTTGTCGG?3’。预计扩增片段长度为945bp。

　　1.2  方法

　　1.2.1  肿瘤细胞疫苗的制备 

    收集培养的Hepa1?6、Hepa1?6?neo及Hepa1?6?m4?1BBL细胞，1×PBS液洗2次，细胞数调至1×1010/L，用MMC（80mg/L）于37℃、50%CO2处理1h，1×PBS液洗3次，重悬细胞，制成肿瘤细胞疫苗备用 (分别称为TCV?Hepa1?6、TCV?Hepa1?6?neo、TCV?m4?1BBL)。

　　1.2.2  MMC处理前后转染细胞m4?1BBL表达的变化

    取对数生长期的Hepa1?6?m4?1BBL细胞稳定表达克隆，以1×105 /孔的浓度铺6孔板，培养48h后，1×PBS洗2次，用MMC（80mg/L）于37℃、50% CO2处理1h，1×PBS洗3次，重新加完全培养液培养，分别于作用前、作用后6h、24h、48h收集细胞提取总RNA，用于RT?PCR检测。

　　1.2.3  C57BL/6小鼠脾细胞悬液制备及混合淋巴细胞培养

    无菌取C57BL/6小鼠脾脏，无菌玻璃针芯研磨并过150目筛网，制备单细胞悬液， RPMI1640洗涤一次，以含10%新生牛血清的RPMI1640重悬细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，置 12孔培养板，分别加入培养液，TCV?Hepa1?6，TCV?Hepa1?6?neo，TCV?m4?1BBL，细胞浓度为 5×105 /ml(脾细胞与TCV比例20∶1)，37℃、50%CO2 培养36ｈ，离心收集培养上清，用于检测细胞因子。

　　1.2.4  IL?2的测定

    采用小鼠脾Ｔ母细胞的MTT法 [4]。无菌取C57BL/6小鼠脾脏，研磨，过150目钢网，0.87%氯化铵 (30～60s)溶解红细胞，PBS洗涤 3次，用含15μg/ml PHA?P、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、10%新生牛血清的 1640培养液制成 1×107/ml细胞悬液，37℃、50%CO2培养48～72ｈ，细胞悬液用淋巴细胞分离液分离，1500r/min离心15min，取中间层淋巴细胞。PBS洗涤2次，计数，调细胞浓度为1×106/ml。取100μl的待测样品及稀释IL?2标准品 (浓度为 100Ｕ/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照 (培养液)，每孔另加入上述细胞悬液各100μl，37℃、50%  CO2 培养24ｈ，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，进行MTT检测。于 96孔培养板中每孔加入MTT  20μl，37℃、50% CO2 培养 4～6h，离心1000 r/min，5min，吸弃上清，每孔加入DMSO200μl，充分吹打混匀或过夜，于酶标分析仪上测定570nm的吸光度值(Ａ)。

    公式：IL?2活性单位=（达50 %最大Ａ值的样品稀释度/达50 %最大Ａ值的标准品稀释度）×标准品单位

　　1.2.5  TNF?α的测定方法

    采用对小鼠L929细胞的细胞毒效应的MTT检测法 [4]。检测时收集细胞悬液，PBS洗涤3次，调细胞浓度为2×105/ml。于96孔板内每孔100μl、37℃、50% CO2培养24h，弃上清。取100μl的待测样品及稀释TNF?α标准品(浓度为100U/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照(培养液)组，每孔另加入放线菌素Ｄ 10μl，37℃、50%CO2培养12～14h，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，于每孔加入MTT  10μl，37℃、50%CO2培养4～6h，吸弃上清，每孔加入DMSO 100μl，震荡后在酶标分析仪上测定570nm的Ａ值

    公式：TNF?α活性单位=（导致50 %细胞死亡的TNF?α标准品最大稀释度/导致50 %细胞死亡的TNF?α样品最大稀释度）×标准品单位

　　1.2.6  GM?CSF的测定方法

    采用GM?CSF依赖的TF?1细胞株作为靶细胞的MTT法 [4]。用含10%小牛血清、GM?CSF 60U/ml的RPMI1640培养液培养TF?1细胞，检测时收集细胞悬液，PBS洗涤 3次，调细胞浓度为1×105/ml。取100μl的待测样品及稀释GM?CSF标准品(浓度为200U/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照(培养液)组，每孔另加入上述细胞悬液各100μl，37℃、50%CO2 培养 24h，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，MTT法检测。于96孔培养板中每孔加入MTT  20μl，37℃、50% CO2培养4～6h，离心1000 r/min，5min，吸弃上清，每孔加入DMSO200μl，充分吹打混匀或过夜 ，于酶标分析仪上测定570nm的吸光度(Ａ)值。

    计算公式：GM?CSF活性单位=（样品达50 %标准品最大Ａ值稀释度/标准品50 %最大Ａ值稀释度）×标准品单位

　　1.2.7  统计学方法

    结果以SPSS10.0统计软件行方差分析，P<0.05为相差显著。

　　2  结果

　　2.1  MMC作用前后肿瘤细胞表达m4?1BBL的变化

    经RT?PCR检测显示Hepa1?6?m4?1BBL细胞经MMC作用后于48h仍能表达m4?1BBL,见图1。

　　2.2  肿瘤细胞疫苗对脾细胞产生细胞因子的影响

    将野生型的Hepa1?6、Hepa1?6?neo及转基因的Hepa1?6?m4?1BBL细胞经丝裂霉素C作用后与同系的C57BL/6小鼠脾细胞共同培养，36h后取培养上清用于检测相关细胞因子，结果显示转4?1BBL基因的瘤苗体外刺激脾细胞产生的IL?2、TNF?α及GM?CSF水平均上升。统计分析表明，与野生型的Hepa1?6瘤苗有显著差异（P<0.05）,见表1。表1  肝癌细胞瘤苗对脾细胞产生细胞因子的影响(略)

　　3  讨论

    4?1BBL为肿瘤坏死因子超家族成员，属于胞膜表面的Ⅱ型糖蛋白，主要表达于活化的抗原提呈细胞如B细胞、巨噬细胞、树突状细胞表面，部分的肿瘤细胞也能表达4?1BBL [5]。4?1BBL与其受体4?1BB作用后可以调节多种免疫细胞的功能，可以有力地共刺激T细胞，使其增殖，增加它们的溶细胞能力 [6]。因此，应用4?1BBL诱发机体的抗肿瘤T细胞反应有着广阔的前景。

    为了研究4?1BBL在抗肝癌免疫中的应用价值，我们将4?1BBL基因导入已知不表达4?1BBL的小鼠肝癌细胞Hepa1?6中并制成肿瘤疫苗，为了保证所需的肿瘤细胞疫苗能保持其高免疫原性及低致瘤性，我们在实验中采用了合适剂量的丝裂霉素C处理肿瘤细胞，结果显示，丝裂霉素C处理后48h肿瘤细胞仍能表达4?1BBL，并且在培养瓶中部分细胞能保持贴壁一周左右，将此瘤苗接种小鼠后不能成瘤。

    以往认为4?1BBL在体内优先诱导CD8+T细胞的活化 [7]。 但是，最近Cannons JL等人却报道了4?1BBL刺激后，CD4+T和CD8+T细胞在发生细胞分裂、维持存活及增强效应功能等方面并无明显区别 [8]。CD8是杀伤性T淋巴细胞表面标志物。CD4是TH细胞表面标志物。目前认为，肿瘤免疫主要激活MHC?I类分子限制的CD8+ T淋巴细胞，同时MHC?II类分子限制的CD4+ T细胞的活化对维持CTL的杀伤活性和免疫记忆都具有十分重要的意义。CD4+的TH1细胞能产生IL?2、IFN?γ、TNF?α和GM?CSF等细胞因子。我们在先前的实验中发现m4?1BBL基因转染的Hepa1?6细胞疫苗能较有效诱导CD8+ T淋巴细胞产生针对野生型 Hepa1?6细胞的特异性杀伤活性。本研究结果显示，将TCV?4?1BBL体外与脾淋巴细胞共培养，其上清中IL?2、TNF?α和GM?CSF水平明显上升，这也说明4?1BBL不但能刺激诱导CD8+ T细胞的活化，同时也能激活CD4+T细胞产生细胞因子，通过这些细胞因子间接激活CD8+细胞可能是其抗肿瘤机制之一。

【】
  　　［1］Hodge JW, Schlom J. Costimulatory molecules in vaccine design［J］. Ernst Schering Res Found Workshop, 2000, 30:23?52.

　　 [2] 刘承利，窦科峰，朱帮福.转4?1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体内抗癌作用的研究［J］.中华普通外科杂志，2004,19(6):352?355.

　　 [3] 刘承利，窦科峰，朱帮福.转4?1BBL基因的小鼠肝癌细胞Hepa1?6生物学特性的观察［J］.中华实验外科杂志，2004,21(6):1145.

　　 [4] 沈关心, 周汝麟. 免疫学实验技术［M］.第1版. 武汉: 湖北技术出版社, 1998.255?284.

　　 [5] Salih HR, Kosowski SG, Haluska VF, et al. Constitutive expression of functional 4?1BB (CD137) ligand on carcinoma cells［J］. J Immunol, 2000,165(5):2903?2910.

　　 [6] Tamada K, Chen L. Renewed interest in cancer immunotherapy with the tumor necrosis factor superfamily molecules［J］. Cancer Immunol Immunother, 2006,55(4):355?362.

　　 [7]Tan JT, Whitmire JK, Ahmed R, et al. 4?1BB ligand, a member of the TNF family, is important for the generation of antiviral CD8 T cell responses［J］.J Immunol, 1999,163(9):4859?4868.

　　 [8] Cannons JL, Lau P, Ghumman B, et al.4?1BB ligand induces cell division, sustains survival, and enhances effector function of CD4 and CD8 T cells with similar efficacy［J］.J Immunol, 2001,167(3):1313?1324.