融合蛋白在肿瘤研究中的应用
【关键词】 融合蛋白;肿瘤研究;应用
0 引言
蛋白质体外表达及其对于蛋白质结构、功能的研究是分子生物学的一个重要组成部分，也是生命到后基因时代的主题。蛋白质体外表达的研究包括了在原核细胞中的融合表达及非融合表达，在真核细胞中如哺乳细胞表达系统、酵母细胞表达系统及昆虫表达系统中的表达。在这些方法当中，以原核细胞中的融合表达较常用，因为融合蛋白容易制备，有较高几率保持原有蛋白的活性及免疫原性，还可进行商品化构建为后续裂解融合蛋白获取其内的真核蛋白提供可能，从而被较多的应用于肿瘤发生及演进机制的研究[1]。本文主要对融合蛋白在肿瘤中的应用作一综述。
1 融合蛋白在对肿瘤发生及演进机制研究中的应用
肿瘤发生及演进是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中涉及癌基因、抑癌基因、mRNA的转录、蛋白质翻译及翻译后修饰、细胞因子及其受体、细胞膜表面蛋白、细胞间粘附功能、跨膜信号改变及信号传导异常、肿瘤相关抗原改变等多方面的异常，目前仍有许多需要攻克的难题。下面主要针对各个实验融合蛋白的最初设计用途进行分类综述，对其涉及的其他结果不予考虑。因为各种肿瘤形成机制不尽相同，融合蛋白应用方式又各种各样，难以统一归纳，现以具体实验为例说明我们的论点。
1.1 融合蛋白与肿瘤发生的研究
1.1.1 融合蛋白与细胞恶性改变 在研究细胞恶性改变时，融合蛋白被应用于研究：(1)特定的融合蛋白是否能导致细胞恶性改变。(2)探求细胞恶性改变的机制。Morimoto等[2]发现滑膜肉瘤的SYT?SSX融合基因的I型转录产生的SYT?SSX融合蛋白通过加强细胞的转录活性，可以明确地促进滑膜肉瘤发生和肿瘤细胞增殖。Wang等[3]运用OCT3—GST构建亲和层析，特异纯化抗OCT3的单克隆抗体检测OCT3在体内的表达，发现其在乳癌中特异表达，因OCT3能促进成纤维细胞生长因子4的融合启动子表达增强、转录增强而最终导致肿瘤发生[3]。
1.1.2 融合蛋白与细胞凋亡及信号传导 Gronbaek等[4]用假想的抗凋亡融合蛋白AP12?MALT1，通过它证实了大部分皮肤外MALT型细胞淋巴瘤和一小部分含有突变的肿瘤细胞能使Fas和bcl10的原凋亡活性失活。在极少数皮肤B细胞淋巴瘤 (PCBCLs)中，只有Fas突变而无bcl10突变，导致了肿瘤细胞存活。Antonella等[5]引入融合蛋白hGM?CSF?Bsd，因PI3K/AKT和Raf/mek/Erk信号传导级连的失调节引起细胞恶变，出现实体性的肿瘤细胞凋亡，为将来靶向治疗肿瘤又提供了一个新的靶点。
1.2 融合蛋白与恶性肿瘤的演进
肿瘤侵袭和转移是一个多步骤、复杂的过程，包括细胞外基质（ECM）和细胞基底膜的降解，肿瘤细胞粘附血管，内渗、外渗、增殖、侵袭和转移。在研究恶性肿瘤的演进时，融合蛋白被应用于研究：（1）特定的融合蛋白是否与恶性肿瘤的演进有关；(2)恶性肿瘤的演进机制; (3)特定的融合蛋白是否能抑制恶性肿瘤的演进。
Reynolds等[6]用融合蛋白EWS?WT1确认了结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)编码基因KTS的DNA结合位点和一个新的EWS?WT1转录靶点，这些揭示了它们可能与该细胞的侵袭有关。 Xia等[7]研究表明，尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)被确认与肿瘤的侵袭和转移有关，利用其受体的抑制蛋白PAI2的融合蛋白ATF?PAI2CD,体外实验证明，通过抑制uPA与其受体结合，能够抑制肿瘤的侵袭能力，但却不能抑制恶性肿瘤的转移。Ariane等[8]通过应用能使血凝固的可溶性组织因子（sTF）的融合蛋白作用于血管细胞粘附分子1（VCAM?1），从而导致肿瘤选择性血管内凝固，肿瘤组织坏死，同时特异性闭锁鼠和人的脉管系统，使肿瘤生长延迟。
2 融合蛋白在对肿瘤治疗、预防研究中的应用
2.1 在传统治疗方法研究中的应用
2.1.1 化学药物治疗 传统的化学药物治疗通常都是全身给药，用药剂量大、效果差、副作用大。用融合蛋白作为载体，可以局部定向用药，增强疗效的同时，一定程度上减少了不良反应。
Tsuneaki等[9]应用抗体定向酶前药物疗法的药物2?fluoro?2′?deoxyadenosine(2?氟?2′?去氧腺苷)。因为在构建时有鸡源亲和素蛋白的存在，因此构建了两个融合蛋白，减轻用化疗药物时伴发免疫反应，从而使酶耦连化疗药物进行靶向治疗成为可能，提高了疗效，减少了副作用。Asakura等[10]在急性B细胞型淋巴细胞性白血病 （ALL）的研究中发现，TEL/AML1融合蛋白是否能抑制MDR?1基因（产生多耐药的基因），结果显示， TEL/AML1融合蛋白能下调MDR?1基因的产物P?糖蛋白，能达到通过降低耐药性而提高治疗效果，同时还与预后有很大关系。
2.1.2 放射治疗 放射治疗的情况类似于化疗，全身反应很严重。Sui Shen等[11]运用融合蛋白包含CC49?（scFv）4和抗生物素蛋白链菌素，该融合蛋白与90Y/111In?DO TA?生物素结合后能将90Y快速分布于肝、脾、骨髓以及肿瘤组织，局部放疗提高了效果，同时减少了放疗的副作用。
2.2 在新兴治疗方法研究中的应用
2.2.1 免疫治疗 对有免疫作用或是免疫抑制作用的蛋白进行融合蛋白的改造，使其获得了外源蛋白的特性，增强或改变了其自身的免疫功能，可以刺激机体产生抗肿瘤免疫。Carey等[12]的研究发现，肿瘤细胞和人单纯性疱疹病毒1（HSV1）通过对避免自身被抗原呈递而免疫逃逸。MHC I /IgG1的融合蛋白耦连了的HSV1糖蛋白B，从而引起特异的T淋巴细胞反应，因此MHC I /IgG1的融合蛋白可以应用于抗原呈递发生改变时增强T淋巴细胞反应。
2.2.2 细胞因子治疗 细胞因子是细胞间传递信号的载体，肿瘤状态下，其发生改变的情况非常复杂。我们在治疗肿瘤时，把它作为工具使用。而融合蛋白对于它的影响也多种多样。
Etanercept（Enbrel）依那西普TNF?α拮抗剂,是研究和应用比较多的细胞因子类药物，也是研究较热的药物，经FDA批准上市。它用途广泛，肿瘤中可用于淋巴细胞癌[13]、滑膜肉瘤（与组织学分级有关，而与融合蛋白SYT—SSX的分型无关）的治疗[14]。TNF?α在体内能增强致炎细胞因子的活性，导致多条信号传导通路活化，包括核内因子κB（NF?κB），该因子与应激反应，角质细胞增生和细胞分化有关，Etanercept能使该因子活性降低。
2.2.3 激素治疗 激素能特异性与其受体结合，因此可以利用此特性，通过对该激素的结构进行融合蛋白的设计，治疗表达该激素受体的肿瘤。Gabriel等[15]研究发现卵巢肿瘤不易早期被诊断发现，睾丸间皮瘤无放疗敏感性。用绒毛膜促性腺激素β（CGβ）的融合蛋白，它能溶解肽段，通过与激素黄体生成素的受体（LHR）结合而起作用。将其应用于转基因小鼠，证实在体外可以导致肿瘤细胞坏死（不是凋亡），对今后治疗表达LHR的肿瘤如睾丸间皮瘤和粒层细胞瘤提供了新型的靶向治疗。
2.2.4 其他
对融合蛋白本身设计用抗肿瘤治疗,这种治疗手段，有的研究用功能蛋白的融合蛋白代替功能蛋白发挥作用。例如，Anginex能抑制体内上皮细胞（EC）的增殖和迁移，从而导致活化的EC脱离和凋亡。用人工的方法在体外构建基因在酵母菌中转录有生物学活性的Anginex融合蛋白，起到了Anginex的作用[16]。
还有的人研究如何抑制肿瘤细胞包含的融合蛋白，从而抑制肿瘤。滑膜肉瘤包含有一个染色体易位，产生了SYT?SSX融合蛋白，该蛋白是功能蛋白，它的存在与肿瘤的结果有关，它能加强细胞的转录活性而诱发肿瘤，通过抑制该蛋白可以起到抗肿瘤的作用[17]。甲硫氨酸（Met）受体酪氨酸激酶的活化基因TRP与融合产生的融合蛋白TRP?MET还可活化细胞内组成蛋白的酪氨酸磷酸化过程，它自身也是酪氨酸磷酸化酶。小分子药物SU11274可以使甲硫氨酸受体酪氨酸激酶抑制，而不影响其他酪氨酸激酶融合蛋白，此特性为今后治疗有此酶活性表达的肿瘤提供了新的靶点[18]。
3 在肿瘤诊断中的应用
肿瘤存在时，机体伴有一系列的蛋白功能改变。有些改变是肿瘤特有的，可以通过检测这些蛋白的存在诊断肿瘤。例如，滑膜肉瘤包含有一个染色体易位，这个部位可以作为一个报告基因，可以通过免疫组织化学的方法和微阵列技术（蛋白芯片）检测由该易位基因转录的融合蛋白，作为肿瘤诊断的作用位点[17]。
4 融合蛋白在肿瘤预防研究中的应用
将肿瘤抗原与其他蛋白相耦连后，能够增强其抗原性。HSP70（热休克蛋白70）具有能特异引起肿瘤免疫，有人将其用遗传学的方法连在疫苗细胞膜上，同时耦连一种带有跨膜序列的超抗原SEA的融合蛋白，两者均作为肿瘤疫苗使用，动物实验结果表明，比起两者单一使用，更有效的刺激淋巴细胞增殖，NK、CTL活性增强，明显肿瘤抑制，生存时间延长。引发特异肿瘤免疫同时也增强机体非特异免疫，是很好的肿瘤疫苗[19]。
综上所述，融合蛋白几乎涉及到肿瘤研究的各个方面，而且也已经取得了较大的成就。同一融合蛋白可以有多种作用，例如SYT?SSX，可以作为诊断的位点，也可以治疗的工具。但是， 由于融合蛋白自身也存在有诸多缺点，最主要的缺点是融合蛋白的不稳定性，它易发生降解，其次融合蛋白在体外真核蛋白不易正确折叠[1]，这些制约着它更广泛的应用。在今后的研究中，需要将融合蛋白裂解获取目的蛋白，在体外促进目的蛋白折叠恢复其天然构象，研究其结构及功能，还可进行蛋白质修饰的研究，这些都是今后研究的主攻方向。
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