胃癌环氧化酶?2、hMLH1及hMSH2微卫星不稳定与基因调控的关系
作者：宋伟庆，周保军，陈怡，韦金英，王烨，韩彩丽
【摘要】 目的 检测临床手术切除43例胃癌及相应正常组织COX?2、hMLH1和hMSH2微卫星不稳定状态MSI及三种基因启动子甲基化情况，并进一步探讨它们与胃癌发生的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术检测5个位点的MSI状态；甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）方法检测胃癌及正常组织COX?2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子CpG岛甲基化状态。结果 43例胃癌中MSI总检出率为48.84%(21/43)，五个位点的MSI检出率无显著差别。COX?2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在43例胃癌中分别有8例和13例，正常组织中未检测到。hMSH2基因启动子CpG 岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。在MSI?H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于MSS组（P<0.01）；而在MSI?H和MSI?L组间以及MSI?L和MSS无差别。MSI?H组中COX?2基因启动子CpG岛甲基化8例，且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX?2基因启动子CpG 岛甲基化。结论 在MSI胃癌（尤其是MSI?H型胃癌）的发生、过程中可能同时出现了hMLH1和COX?2基因启动子CpG岛的甲基化（即表型遗传修饰）。MSI胃癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS胃癌，提示检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化对于判断肿瘤类型有一定意义。
【关键词】 胃癌；环氧化酶?2；hMLH1；hMSH2；聚合酶链反应；甲基化特异性聚合酶链反应
Abstract：Objective To investigate the COX?2, hMLH1 and hMSH2 of genes promoter methylation and MSI frequency in 43 cases of human gastric carcinoma and normal tissues, and to evaluate the relationship between them and occurrence of gastric carcinoma. Methods Methylation specific PCR (MSP) and polymerase chain reaction (PCR) methods were employed in this study in order to investigate the promoter methylation of these genes and 5 loci MSI frequency in human gastric carcinoma and normal tissues. Results Of 43 gastric carcinoma cases, the total frequency of MSI was 48.84% (21/43). The MSI frequency no significant discrepancy was found among the 5 loci. Cases with methylation of COX?2 and hMLH1 gene promoter CpG islands in gastric carcinoma were 8 and 13, and they were not detected in normal tissues. Methylation of hMSH2 gene promoter CpG islands was not detected in gastric carcinoma or normal tissues. The methylation rate of hMLH1 gene promoter CpG islands in MSI?H was higher than that in MSS (P<0.01). There was no significant difference between MSI?H and MSI?L, and the same result was found between MSI?L and MSS. 8 cases with methylation of COX?2 gene promoter CpG islands only occurred in MSI?H gastric cancer, and 7 cases both with methylation of COX?2 and hMLH1 gene promoter CpG islands was observed in MSI?H. Conclusion Methylation of hMLH1 and COX?2 gene promoter CpG islands may both occur in the development of MSI gastric carcinoma. The methylation rate of hMLH1 gene promoter CpG islands in MSI gastric carcinoma was higher than that in MSS gastric carcinoma. It suggested that detecting the methylation of hMLH1 gene promoter CpG islands might be a useful method for determining the gastric carcinoma type.
Key words：Gastric carcinoma；Cyclooxygenase?2；hMLH1；hMSH2；Polymerease chain reaction；Methylation specific polymerease chain reaction
0 引言
MSI是指由于DNA复制错误引起的简单重复序列的增加或减少。MSI的出现使MS不能正常地发挥调控作用,引起细胞的增殖及分化发生异常，由此导致了肿瘤的发生。目前认为错配修复酶表达缺失或减少，导致MS的复制错误不能被修复，使一个或多个重复单位增加或丢失，是MSI产生的主要原因。
研究发现[1]在一部分散发性MSI结直肠肿瘤中，hMLH1基因的突变率却很低，其蛋白表达减少可能经由其他途径所致，譬如基因的表型遗传修饰[2]。以DNA甲基化方式来修饰基因的表达称为基因表型遗传修饰。真核生物的甲基化大多发生在CpG核苷酸的胞嘧啶上。本研究采用PCR、甲基化PCR等方法，探讨COX?2、hMLH1、hMSH2基因启动子甲基化与MSI关系的研究，为进一步阐明胃癌发生机制提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
收集河北医科大学附属第二胃肠外科2003年1月～2004年12月手术切除新鲜胃癌及相应距癌组织远端最远部位胃正常组织（>10cm，后文均称正常组织）各43例，所有组织均经病理诊断证实。所有患者术前均未接受放疗或化疗。
1.2 主要试剂
hMLH1多克隆抗体（BA0511）（武汉博士德生物工程有限公司）；hMSH2（SC?494）、COX?2（SC?1746）多克隆抗体（Santa Cruz公司），一抗工作液浓度分别为1∶100、1∶200、1∶100。第二抗体马抗山羊（ZB?2306）、山羊抗兔（ZB?2301）IgG（H+L），DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司），二抗工作液浓度为1∶1 500。
1.3 方法
1.3.1 甲基化特异性PCR
（1）胃癌及正常组织COX?2、hMLH1及hMSH2基因启动子基化的检测 采用甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）方法检测3种基因启动子CpG岛甲基化状态。富含CpG的DNA序列称为CpG岛，真核生物的甲基化大多发生在CpG核苷酸的胞嘧啶上。DNA经亚硫酸氢钠作用后，未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，发生甲基化的胞嘧啶则无改变。根据DNA修饰后的变化，分别设计甲基化和非甲基化两对特异性引物，进行MSP。
（2）基因组DNA亚硫酸氢盐修饰 DNA亚硫酸氢盐修饰方法参见[3]，取3μgDNA，补三蒸水至40μl，加入1mol/L氢氧化钠10μl，37℃保温10min；加入3mol/L亚硫酸氢钠520μl和10mmol/L对苯二酚30μl，覆盖石蜡油，50℃保温18h；DNA提纯试剂盒洗脱，加入1.5mol/L氢氧化钠室温5min，乙醇沉淀、离心，?20℃保存。
（3）甲基化PCR反应条件 COX?2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子甲基化及非甲基化引物参照文献[4]，见表2。反应体系为20μl∶模板（经修饰的DNA）200ng，10×缓冲液（含MgCl2）2μl，引物各15pmol，dNTPs0.5μl，RedTaqDNA聚合酶1.5μl，三蒸水补至20μl。采用Biometra基因扩增仪（德国）扩增，扩增条件：95℃预变性5min（未加Taq酶）后，再加入Taq酶，循环参数为95℃45sec，60℃～61℃60sec，72℃90sec，35个循环，72℃延伸10min。每次扩增均设阴性对照，即用三蒸水代替模板扩增，无扩增产物即说明PCR无污染。产物行2%琼脂糖凝胶电泳，结果由凝胶成像系统照相保存。
（4）结果判断标准
以远端正常胃组织为对照，PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳后在相应位置（COX?2、hMLH1、hMSH2）出现条带（目的条带）则可判断存在甲基化或非甲基化。
1.3.2 MSI检测
选用BAT?25、BAT?26、D2S123、D17S250、D5S346五个微卫星位点。赛百胜DNA提取试剂盒提取癌及癌旁正常组织基因组DNA，紫外分光定量后备用。引物序列从http://www.gdb.org中查询，见表1。表1 引物序列（略）
引物及PCR反应用品均购自赛百胜生物试剂公司。上述位点均采用同一条件扩增，反应体系为20μl，模板200ng，10×缓冲液（含MgCl2）2μl，引物各15pmol，dNTPs0.5μl，RedTaqDNA聚合酶1.5μl。表2 引物序列（略）
预变性94℃ 2.5min，循环参数为94℃ 45sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，35个循环，72℃延伸10min。产物行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后凝胶成像照相保存。结果判定：与正常组织相比，肿瘤组织出现泳动条带增多或减少或等位条带移位，即判断为MSI（阳性病例均重复实验2次）。根据突变型微卫星位点的多少，将其分为MSI?H, MSI?L和MSS。
1.3.3 统计学处理
应用SAS6.12软件对结果进行统计处理。COX?2、 hMLH1启动子甲基化及微卫星不稳定间相互关系用chi?square及χ2 Pearson关联性检验或Fisher′s确切概率法检验。检验水准为0.05。
2 结果
2.1 43例胃癌中MSI总检出微卫星不稳定检测结果
43例胃癌中MSI总检出率为48.84%（21/43），BAT?25，BAT?26，D2S123，D5S346，D17S250五个位点MSI的检出率分别为20.93%（9/43），32.56%（14/43），30.23%（13/43），20.93%（9/43），20.93%（9/43）。五个位点的MSI检出率无显著差别。其中，高频率微卫星不稳定14例。低频率微卫星不稳定7例，微卫星稳定22例，见图1。
2.2 COX?2、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化检测结果 见图2～5。
在43例胃癌基因启动子CpG岛甲基化中COX?2有8例,hMLH1 13例。hMSH2基因启动子CpG岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。
2.3 COX?2、hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛甲基化与MSI
MSI?H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率为78.57%（11/14），显著高于MSS组（0/22，0%）hMLH1基因启动子甲基化率（P<0.01）；而在MSI?H（11/14，78.57%）和MSI?L（2/7，28.57%）组间以及MSI?L（2/7，28.57%）和MSS（0/22，0%）组间hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率无差别。MSI?H组中COX?2基因启动子CpG岛甲基化胃癌标本8例，且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX?2基因启动子CpG 岛甲基化。
3 讨论
本实验室[5]在研究了78例结肠癌患者中发现hMLH1蛋白表达降低。发现[6] hMLH1基因的表达降低可能与其启动子CPG岛甲基化存在关系，但甲基化产生机制尚不清楚。目前，国际上把与CpG岛的甲基化有关的肿瘤称作CpG岛甲基化表型（CIMP）阳性肿瘤。
本研究发现，在MSI胃癌中有13例出现hMLH1基因启动子CpG岛甲基化，而在MSS胃癌中则无甲基化发生，提示hMLH1基因启动子CpG岛甲基化与MSI胃癌发生关系密切（MSI?H和MSI?L胃癌间hMLH1基因启动子甲基化率无差别）。有研究发现[7]去甲基化剂可恢复由于甲基化而失活的基因表达活性（如hMLH1基因），这为今后CIMP阳性肿瘤提供了一个新的治疗靶点。本研究未在胃癌中检测到hMSH2基因启动子甲基化，这与房殿春等[8]在结肠癌中的研究结果一致。提示在胃癌中hMSH2蛋白低表达可能与其基因启动子CpG岛甲基化无关，其表达降低原因仍需进一步分子水平的研究。
环氧化酶（Cyclooxygenase，COX）具有两种同工酶，其中COX?1又称构建型COX，主要合成生理性PG，维持正常的生理功能，在大多数细胞中都稳定表达；COX?2又称诱导型COX，正常情况下绝大多数组织中无表达，仅在细胞受到各种因素（如细胞因子、生长因子、癌基因、促癌剂、肿瘤促进因子等）作用时迅速从头合成，并参与炎症及肿瘤的发生、。研究发现，在伴有MSI的胃癌和结肠癌中，COX?2蛋白的表达明显减少，并且Akhtar等[9]证实，COX?2基因启动子CpG岛甲基化可导致COX?2蛋白表达降低。
43例胃癌甲基化检测中发现，8例出现COX?2基因启动子CpG岛甲基化，全部出现在MSI?H胃癌（8/14，57.14%）。上述结果提示，MSI胃癌尤其是MSI?H胃癌中可能伴有因COX?2基因表型遗传修饰而导致的蛋白表达降低，这与其他学者的研究结果基本相同，因此考虑COX?2在MSI胃癌的发生、发展中作用不大。
本研究结果认为，胃癌的发生可能存在MSI和MSS途径，即可以分为MSI和MSS两型胃癌。部分MSI胃癌（尤其是MSI?H胃癌）在发生过程中同时出现了hMLH1和COX?2基因的表型遗传修饰，导致hMLH1和COX?2蛋白表达降低，提示hMLH1基因的表型遗传修饰产生MSI是MSI型胃癌发生的重要机制；而COX?2在此类胃癌的发生中作用不明显。应用去甲基化剂可恢复由于基因启动子CpG岛甲基化导致的蛋白表达抑制，但对同时出现hMLH1和COX?2基因启动子CpG岛甲基化的MSI胃癌，去甲基化剂可恢复COX?2蛋白表达[10]而促进肿瘤的发展，因此针对此类胃癌，去甲基化剂是否具有临床应用价值尚需进一步研究。MSS胃癌发生过程中常出现COX?2蛋白表达升高，提示COX?2蛋白可能是MSS胃癌发生、发展的重要促进因素，但MSS胃癌的具体发生机制仍需探讨。
【】
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