丹皮酚对人大肠癌HT?29细胞bcl?2和bax基因表达的影响

【关键词】  大肠癌 bcl?2 bax 丹皮酚　

    化疗药物的耐药[1]及其毒副作用一直是大肠癌的两大难题，因此在植物中寻找有效且副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的研究课题。研究表明，丹皮酚(Paeonol,Pae)具有一定的抗肿瘤活性，灌胃给药有抗小鼠肝肿瘤作用[2]。我们已报道Pae在体外能显著抑制人大肠癌HT?29细胞的增殖[3]。为进一步探索这种抑制作用的可能机制，我们进行了以下研究，为Pae的临床应用提供理论和实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    常规培养HT?29细胞，取对数生长期细胞用于实验。细胞分为实验组和对照组，其中实验组分别加入不同浓度的Pae溶液（分别为15.63mg/L、62.5mg/L、250mg/L），对照组加入等量培养液。

    1.2  Pae诱导细胞凋亡的研究

    1.2.1  倒置显微镜下观察  常规培养瓶内培养HT?29细胞，倒置显微镜下连续性动态观察细胞生长情况。

    1.2.2  TUNEL法检测细胞凋亡  细胞接种于置有盖玻片的6孔培养板中,贴壁后分为实验组和对照组, 48ｈ后取出盖玻片，按TUNEL试剂盒说明进行处理。光镜下观测，胞核染色呈棕褐色被判为凋亡细胞，随机选取5个高倍镜（×200）视野，每个视野计数200个细胞，凋亡指数 （AI） = 凋亡细胞数/总细胞数×100%。

    1.2.3  流式细胞仪检测细胞周期  消化收集各实验组及对照组培养48ｈ的细胞，离心、漂洗、过滤、固定，加入RNase及PI染色，上机检测。

    1.3  凋亡相关基因bcl?2、bax的检测

    细胞接种及分组同TUNEL法，48ｈ后漂洗、固定，滴加一抗(bcl?2、bax抗体)，以PBS代替一抗作为阴性对照，余步骤按SP试剂盒操作说明进行。每张玻片在40×10高倍显微镜下观察，细胞染色呈棕褐色被判为阳性细胞,不染为阴性细胞。凋亡相关基因蛋白bcl?2、bax定位于胞浆和胞膜。每个视野下分别：表达率（%）= (阳性细胞数/细胞总数)×100%，每张涂片观察5个视野。

    1.4  统计学处理

    使用SPSS10.0统计软件。  

    2  结果

    2.1  Pae对HT?29细胞凋亡的诱导作用

    2.1.1  倒置显微镜下观察  对照组细胞生长旺盛，呈高折光率，胞体大。Pae组细胞增殖减慢，随着药物浓度增大和时间延长，细胞逐渐变小、折光率减弱，部分脱落漂浮于培养瓶中，但细胞膜完整，最后裂解。

    2.1.2  TUNEL法  实验组凋亡细胞的棕褐色染色颗粒定位于细胞核内，染色阳性的细胞出现细胞核碎裂，核质固缩，细胞膜突出形成质膜小泡等凋亡细胞形态学变化(图略)。经Pae处理48ｈ， HT?29细胞株的凋亡细胞数明显增加，差异均有显著性(P<0.01)，且AI与Pae浓度呈正相依赖关系，见表1。表1  各组凋亡指数的比较

    2.1.3  流式细胞仪检测  不同浓度的Pae作用于HT?29细胞48ｈ后，细胞周期分布发生明显改变，表现为S期细胞比例上升，G0/G1期和G2/M期细胞比例下降，见表2，并出现明显的凋亡峰，见图1a～1d。两组结果相比差异均有显著性(P<0.05)。

    2.2  Pae对凋亡相关基因bcl?2、bax表达的影响  见表3。表2  Pae对HT?29细胞周期的影响

    2.2.1  bcl?2蛋白表达  对照组的bcl?2蛋白表达水平最高，胞浆染色细胞数最多并且呈深棕色，Pae组细胞bcl?2表达均有下降，染色阳性细胞减少，染色明显变浅，且与药物浓度呈反比关系，各组结果与对照组相比均具有显著性差异(P<0.01)（图略）。

    2.2.2  bax蛋白表达  阳性细胞胞浆、胞膜染成深棕色。Pae组染色阳性细胞数及染色程度与对照组相比无显著性差异(P>0.05) （图略）。

    3  讨论

    细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生、的关键[4]。众多研究业已表明，细胞凋亡的减少与大肠癌的发生、发展相关。多种化疗药物均可引起肿瘤细胞凋亡[5]。通过诱导凋亡治疗肿瘤是目前的一个热点[6]。本实验中Pae作用于大肠癌HT?29细胞，通过光镜可观察到典型的凋亡细胞形态学改变。TUNEL法发现经Pae处理后大肠癌细胞的凋亡指数显著提高，且与Pae呈剂量依赖关系。流式细胞仪发现Pae作用后出现了明显的凋亡峰，细胞周期分布也发生了明显变化，表明Pae对HT?29细胞周期分布的影响主要是阻滞细胞周期中Ｓ期向Ｇ2/Ｍ期的转变过程,减少有丝分裂,并引起细胞凋亡。证实Pae 作用于HT?29细胞的作用机制与诱导该细胞株凋亡及影响其细胞周期分布有关。

    细胞凋亡是多基因调控的程序化过程。通过研究其分子调控机制，将对有计划地诱导肿瘤细胞凋亡产生重要的指导作用[7]。与细胞凋亡相关的基因大致有bcl?2家族、p53、Fas、c?myc、k?ras等，其中bcl?2是凋亡调控的中心环节。体外实验表明，去除了生长因子后, 正常细胞便逐渐转向凋亡；而当bcl?2过度表达时，这一凋亡现象便被抑制[8]。由此可见,bcl?2可通过抑制凋亡延长细胞寿命，产生细胞过度增殖和堆积，在肿瘤发生中起始动作用。bax基因是近年来新发现的一种凋亡促进基因，属bcl?2同一家族[9]。bax基因的作用与bcl?2相反，其单体以及bax/bax形式的同源二聚体均有促凋亡作用。bax又可与bcl?2形成异源二聚体，抑制后者的功能促进凋亡。近期研究表明，bcl?2家族中促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡在调节促凋亡因子c?myc从线粒体的释放起着重要的作用[10]。bcl?2/bax两蛋白之间的比例是细胞凋亡发生与否的关键因素[11]。本实验发现，Pae能明显下调大肠癌HT?29细胞bcl?2基因的表达，而bax在Pae作用后与对照组相比表达率无明显差异，故可认为经Pae作用后是通过bcl?2/bax比例的下降，从而诱导大肠癌细胞的凋亡。

    综上所述，本实验研究发现中药丹皮酚在一定的浓度范围内能显著下调人大肠癌HT?29细胞bcl?2/bax的比例，因此，丹皮酚的抑瘤机制之一可能是通过作用于bcl?2和bax基因来诱导肿瘤细胞的凋亡。

【】
  ［1］ Litvak DA, Bilcbik AF, Cabot MC. Modulators of Ceramide Metabolism Sensitize Colorectal Cancer Cells to Chemotherapy: A Novel Treatment Strategy /[J/]. J Gastrointest Surg, 2003,7(1):140?148.

　　［2］ 孙国平,沈玉先,张玲玲，等.丹皮酚对ＨｅｐＡ荷瘤小鼠免疫调节和抑瘤作用研究/[J/].药通报,2003,19(2):160?162.

［3］ 计春燕，谭诗云，刘长青.丹皮酚抑制人大肠癌细胞增殖及其与化疗药物的协同作用/[J/].中国肿瘤临床，2005,32(9):513?515.

［4］ Tin Oo Khor, Yunus A Gul, Hairuszah Ithnin,et al. Positive correlation between overexpression of phospho?BAD with phosphorylated Akt at serine 473 but not threonine 308 in colorectal carcinoma/[J/]. Cancer Letters,2004,210(1):139?150.

［5］ Coter TG, Glymn JM, Echeverri F, et al. The induction of Apoptosis by chemotherapeutic agents occurs in all phase of the cell cycle/[J/].Anticancer Res, 1992,12(1):773.

［6］ Dong JT, Luo XM. Effects of arsetic on DNA damage and repair in human fatsllung fibroblasts/[J/].Mutation Res,1994,321(1):111.

［7］ Qi?Long LU, Richard P, Leslie W, et al. Bcl?2 expression in adult and embryonic non?haematopoietic tissues/[J/]. J Pathol, 1993,200(1):360.

［8］ Garcia I, Martinou I, Tsujimoto Y, et al. Prevention of programmed cell death of sympathetic neurous by the bcl?2 proto?oncogene/[J/]. Science,1992,258(1):302?304.

［9］ Adams JM, Cory S. The Bcl?2 protein family: aibiters of cell suivival/[J/]. Science, 1998, 281(1): 1322?1326.

［10］J B Tuynman, M P Peppelenbosch, D J Richel. COX?2 inhibition as a tool to treat and prevent colorectal cancer/[J/]. Critical Reviews in Oncology/Hematology/[J/]. 2004,52(1):81?101.

［11］Rosse T, Olivier R, Monney L, et al. Bcl?2 prolongs cell survival after Bax?induced release of cytochrome c/[J/]. Nature, 1998,391(1):496?499.