靶向遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

           作者：黄锦，林菊生，常莹，周秀敏　

【摘要】  目的 构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法 根据PEG10基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNA?hH1neo中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论 本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体，可能成为肝癌基因中的一种新型、高效的治疗载体。

【关键词】  遗传印记基因；PEG10；siRNA；真核表达载体；鉴定

    原发性肝细胞癌基因治疗面临的一大难题，是寻找参与绝大多数肝癌发病关键性的特异分子靶。PEG10（Paternally expressed gene 10）是2001年Ryuichi Ono等用cDNA微阵列在肝细胞癌组织中发现的一个新的遗传印记基因，它在肝癌中表达的特异性提示可能参与肿瘤细胞生长失控[1]。本研究采用分子克隆技术，构建了针对PEG10的siRNA真核表达载体，通过酶切鉴定和测序鉴定鉴定其结构。

    1  材料与方法

    1.1  材料  质粒psiRNA?hH1neo购自美国InvivoGen公司，受体菌E.coli DH?5α由本实验室保存。限制性内切酶BbsⅠ和AseⅠ及T4DNA连接酶购自美国NEB公司，M?MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂Rnasin和Taq聚合酶为美国Promega公司产品。高纯质粒提取试剂盒购自杭州V?gene公司，DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。DNA由上海生工生物工程公司合成。

    1.2  方法

    1.2.1  siRNA靶序列的设计和筛选  利用NCBI Genbank检索PEG10 mRNA的全长序列，参照siRNA设计原则，并运用RNA structure软件模拟靶mRNA的二级结构，尽量避免自身结合的茎区，选择配对区域较少的序列，如线区和环区。筛选出4个21个核苷酸的序列，分别命名为psiRNA1 （GCAGAAGCTCACAGAGGAGAA）、psiRNA2 (GCACAACTACCCAGCTTTCAT)、psiRNA3 (GGCAGTGCATTCACATTGAGA)和psiRNA4 (GTTCGATGGCAACCCAGACAT)。两端均引入BbsⅠ酶切位点。

    1.2.2  靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建

    1.2.2.1  shRNA表达模板的制备  将化学合成的正义链和反义链退火，形成shRNA表达模板，表达模板由正义链＋loop（CCACC）＋反义链组成，两端为酶切位点。

    1.2.2.2  psiRNA?hH1neo载体酶切  Invivogen公司psiRNA?hH1neo质粒，H1启动子下游有两个BbsⅠ酶切位点，酶切反应后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收2 640bp片断，实验步骤按照华舜DNA凝胶回收试剂盒说明书操作。回收后通过紫外分光光度计定量。

    1.2.2.3  连接及转化  将shRNA表达模板和psiRNA?hH1neo酶切产物按4∶1的比例混合，T4DNA 连接酶27℃连接过夜，转化感受态DH?5α大肠杆菌中，取振摇后的转化菌，均匀涂抹在含χ?gal和IPTG的卡那琼脂平板上，倒置培养过夜。观察菌落生长情况，蓝白斑筛选，挑取白色单克隆。

    1.2.2.4  质粒的扩增和提取  将挑取的菌落分别接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、250r/min振摇12～14h。取3ml转化菌液，按照V?gene公司超纯质粒抽提试剂盒说明书步骤提取质粒，取1μl在1％的琼脂糖电泳，通过灰度扫描定量。

    1.2.2.5  质粒的鉴定  ①酶切鉴定：将提取的重组质粒和psiRNA?hH1neo空质粒，用限制性内切酶AseⅠ进行酶切鉴定。 ②测序鉴定： 取1ml转化菌液，送上海英骏生物技术公司进行测序鉴定。测序引物：5’CCCTAACTGACACACATTCC3’，测序方法为反向测序。

    2  结果

    2.1  重组载体酶切鉴定结果  用AseⅠ分别酶切重组载体和空载体，见图1，重组质粒酶切后呈线性化，电泳出一条带；空质粒组得到752bp和2 227bp两条带；未经酶切的质粒分别为电泳出超螺旋环状DNA、线状DNA、切口环状DNA三条带。以上结果均与预期相符。

    1. psiRNA?hH1neo AseⅠ; 2. psiRNA1 AseⅠ;3. psiRNA1  Lane; 4. psiRNA2 AseⅠ; 5. psiRNA2;6. psiRNA3 AseⅠ;7. psiRNA3; 8. psiRNA4 AseⅠ;9. psiRNA4; M. Marker Ⅲ图1  重组质粒酶切鉴定结果

    2.2  测序结果  将DNA测序结果通过DNAssist 2.2软件进行比对，与预先设计结果完全相符。说明已将4个不同序列的siRNA分别成功克隆至载体psiRNA上，可以用于后续研究。

    3  讨论

    遗传印记基因PEG10来源于病毒反转录转座子，是属于父方表达的印记基因。父方表达的印记基因可促进细胞的生长，使个体发育更加强壮，而这类基因的过表达就有可能导致细胞的恶性转化[2?4]。研究发现，PEG10在小鼠再生肝和人类肝细胞癌组织中高表达，在相应的癌旁及正常人肝、胰、结肠、胃、淋巴和表皮中均不表达[5，6]。我们的前期研究表明，PEG10在肝癌组织中的表达具有特异性，人肝癌细胞系HepG2中PEG10高表达[7]。因此，PEG10有可能是一个潜在的肝癌基因的分子靶。

    RNAi技术作为一种新的基因沉默手段，以其严格的序列特异性、高效性及高度稳定性的特点迅速成为研究的热点，并逐渐成为研究基因功能和肿瘤基因治疗的重要工具。目前常用的制备siRNA的方法有化学合成法、体外转录法、 “鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）、表达载体法和表达框法等5种，本实验采用的真核表达载体法克服了其他方法成本高，步骤繁琐的缺点，具有简单、快捷、的优点，利用真核表达载体可以进行瞬时转染或建立稳定的转基因细胞系，便于进行短期和长期的研究。本研究选择psiRNA?hH1neo载体，其H1启动子是RNA聚合酶Ⅲ启动子，它能够精确高效的转录出shRNA，进而在体内被切割成为siRNA，提高了RNAi的特异性和效率。在H1启动子下游有2个BbsⅠ酶切位点，通过BbsⅠ酶切后可以产生非粘性末端，即提高了酶切的效率又简化了酶切步骤，防止载体的自身环化。

    siRNA的靶位点的选择是RNAi成功的关键，其设计原则通常包括G/C含量在40％～55％之间，避免4个A、T、C和G相连的序列，Blast分析排除同源性。实验中一般针对每个目的序列设计3～4对siRNAs，筛选出最有效的进行后续研究。siRNA对目的基因靶位点的识别具有高度的序列特异，通过碱基配对完全互补的序列才能发挥作用。而且，RNA二级结构对siRNA作用的影响非常显著[8，9]。本研究选取的4个靶位点，均考虑到了RNA二级结构的影响，其中psiRNA1和psiRNA2为线状结构、psiRNA3和psiRNA4为环状结构。结果显示，相同的GC含量，线状结构（psiRNA2）对

    PEG10 mRNA的抑制作用最强，表明靶mRNA的二级结构对siRNA的功能有很大影响。

    本研究中我们构建针对PEG10基因的siRNA真核表达载体，并通过酶切鉴定和测序鉴定，说明我们构建的针对PEG10的真核表达载体是正确有效的，可以用于后续PEG10基因功能的研究，以及沉默PEG10后抑制肝癌细胞生长，诱导肝癌细胞凋亡，从而为肝癌的基因治疗提供理论依据和实验工具。

【】
  ［1］ Ryuichi Ono, Shin Kobayashi, Hirotaka Wagatsuma, et al. A retrotransposon?derived gene, PEG10, is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q21/[J/]. Genomics, 2001, 73(2): 232?237.

［2］ Noble A, Towne C, Chopin L, et al. Insulin?like growth factor?Ⅱ bound to vitronectin enhances MCF?7 breast cancer cell migration/[J/]. Endocrinology，2003, 144(6): 2417?2424.

［3］ Moorehead RA, Sanchez OH, Baldwin RM, et al. Transgenic overexpression of IGF?Ⅱ indues spontaneous lung tumors: a model for human lung adenocarcinoma/[J/]. Oncogene，2003, 22(6): 853?857.

［4］ Vella V, Sciacca L, Pandini G, et al. The IGF system in thyroid cancer: new concepts/[J/]. Mol Pathol， 2001, 54(3):121?124.

［5］ Tsou AP, Chuang YC, Su JY, et al. Overexpression of a novel imprinted gene, PEG10, in human hepatocellular carcinoma and in regenerating mouse livers/[J/]. J Biomed Sci，2003, 10(6 Pt 1): 625?635.

［6］ Hiroshi Okabe, Seiji Satoh, Yoichi Furukawa, et al. Involvement of PEG10 in human hepatocellular carcinogenesis through interaction with SIAH1/[J/]. Cancer Research, 2003, 63(12): 3043?3048.

［7］ 常莹，陶璐薇，陈孝平，等. 肝癌组织中遗传印记基因PEG10表达的特异性及其意义/[J/]. 世界华人消化杂志， 2005, 13(12): 1408?1411.

［8］ Naito Y, Yamada T, Ui?Tei K,et al.siDirect: highly effective, target?specific siRNA design software for mammalian RNA interference/[J/]. Nucleic Acids Res， 2004, 32: W124?129.

［9］ Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference/[J/]. Nat Biotechnol， 2004, 22(3): 326?330.