青蒿琥酯抑制MCF?7细胞的机制探讨

                    作者：赵小波 ，刘明学，吴凯南， 幸天勇

【摘要】  　　目的 探讨青蒿琥酯（Artesunate,ART）对乳腺癌细胞MCF?7抑制作用及其机制。方法 ART处理细胞3天后，采用MTT比色法检测细胞增殖功能，观察细胞形态、结构的改变，免疫细胞化学检测bax、nm23、PCNA、VEGF、bcl?2蛋白的表达情况。结果 ART对乳腺癌细胞MCF?7的抑制作用呈明显浓度依赖性，可导致细胞形态、结构的改变；免疫细胞化学结果显示20μmol/L青蒿琥酯作用两种细胞72小时后，可上调bax、nm23，下调PCNA、VEGF蛋白的表达，bcl?2蛋白表达无明显变化。结论 ART有抑制MCF?7细胞增殖的作用，其机制可能与上调bax、nm23，下调PCNA、VEGF蛋白的表达有关。

【关键词】  青蒿琥酯　bax;nm23　PCNA;VEGF;bcl?2

　　Effects of Artesunate and Its Mechanism on MCF?7 Cells

     1.Department of General Surgery,The  Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China;2.Department of General Surgery,The  Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical science

       Key words：Artesunate;bax;nm23;PCNA;VEGF;bcl?2

　　近年，中药在提高癌症患者的生存质量和延长生存期等方面对乳腺癌的带来了新的契机。抗疟药青蒿琥酯（ART）是青蒿素衍生物，体内外实验证实对肝癌细胞有诱导凋亡的作用[1，2],对结肠癌等55种细胞株均有细胞毒作用[3]。国内尚未见ART对人乳腺癌细胞影响的相关报道。本实验采用ER阳性的乳腺癌细胞株MCF?7为研究对象，探讨ART抑制乳腺癌细胞作用及其机制，为进一步研究提供理论依据。

    1材料与方法

    1.1药物、试剂及其配置

    1.1.1药物

    ART由广西桂林第二制药厂生产。60mg ART由5%碳酸氢钠1ml配成储备液，-20℃保存。实验时用1640液稀释所需浓度，碳酸氢钠的终浓度＜0.09%。

    1.1.2试剂

    RPMI?1640（购于美国Hyclone公司），10%小牛血清（购于杭州四季青生物工程材料有限公司）,80mg/L青霉素及120mg/L链霉素（购于重庆医大附一院药房），MTT（购于Sigma公司）。

    1.2细胞培养与处理

    MCF?7购于中科院上海生物研究所细胞库。用含10%小牛血清的1640培养基，在37℃、体积分数为5%的CO2孵箱中常规培养传代。细胞长至瓶底80%～90%时处于对数生长期，用0.05%胰酶—0.02% EDTA消化后，5min 800转离心，弃上清液，1640培养基制成单细胞悬液即可备用。

    1.3 MTT比色法检测细胞增殖功能

    1.3.1实验分组

    实验分为九组：空白对照组、细胞对照组、溶剂对照组（0.09% NaHCO3）、药物组（2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）。

    1.3.2步骤

    将5.0×104/ml浓度细胞加入96孔板中，200μl/孔。培养24h后，细胞贴壁，分别加入不同处理因素。每组设八个平行孔，在额定的时间取出培养板，吸去各孔培养液，换上200μl无血清1640并加入20μl的MTT（5mg/ml）,轻振培养板，放回CO2孵箱中再培养4h后，10min 4000转离心，弃上清液，加DMSO 200μl/孔,振荡器上振荡5～10min，空白调零，在微量板读数仪中测出每孔中600nm处的OD值。并出ART对乳腺癌细胞的抑制率，重复3次。

    乳腺癌细胞存活率=抗癌药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值×100%

    乳腺癌细胞抑制率=1-乳腺癌细胞存活率

    1.4形态学观察

    20μmol/L ART处理细胞3d后，细胞HE染色后在光学显微镜下观察。

    1.5免疫细胞化学检测

    1.5.1步骤

    细胞爬片用PBS洗两次。过氧化氢孵育10min，TritonX?100/PBS穿孔，1%胰酶37℃消化30min，PBS冲洗后，滴加试剂1（正常三阳血清）封闭无关抗原，室温孵育10～15min，滴加适当一抗工作液，4℃冰箱过夜，滴加生物素二抗，室温孵育，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素， DAB显色，复染，酸酒精褪色后封片。

    1.5.2判断标准

    参照Lessey等[4]判断标准，阳性细胞染成棕黄色，用HSCORE系数作半定量评分。计算出100个细胞中各强度的百分比，求HSCORE的值，并取其平均值。

    1.6统计学处理

    实验采用SPSS10.0软件包进行方差分析。

    2结果

    2.1MTT比色法结果

    细胞对照组与NaHCO3组的吸光度值之间无显著性差异，说明溶剂NaHCO3液对MCF?7细胞生长无影响。ART对MCF?7细胞有抑制作用，随作用浓度和作用时间的增加，药物的抑制作用加强，有剂量?效应和时间依赖的趋势，见图1。

    图1  MTT法检测不同浓度ART作用

    不同时间对MCF?7细胞的影响（±s）

    确定半数抑制药物浓度（IC50值）。利用回归方程求出ART作用72h，细胞被抑制50%的药物浓度值，IC50为7.8μmol/L。

    2.2形态学观察结果

    光镜下，HE染色的MCF?7细胞胞核蓝色，细胞浆红色。细胞贴壁形态为三角型居多，分化较好，多核细胞少见。细胞之间首尾相接，有形成腺腔样结构的趋势，见图2。20μmol/L ART作用3d，细胞正常结构改变，排列疏松，呈分离状态，变圆，漂浮细胞增加,可见到细胞死亡典型的形态学改变：细胞皱缩，胞质浓缩，核固缩、凝聚，呈深蓝染。胞膜破裂，胞浆内容物外溢，呈现模糊无结构的颗粒状红染物质,见图3。

    2.3免疫细胞化学检测结果  见表1表1  ART影响增殖凋亡调控及转移相关蛋白的表达注：B1、B2分别为各组的平均HSCORE值，用±s表示。*与对照组比较*P＜0.05    乳腺癌细胞中bcl?2、bax、nm23、VEGF的表达定位于细胞浆，同时，bax、VEGF胞核中也有阳性颗粒。PCNA蛋白质表达定位于细胞核。方差分析结果显示：ART 20μmol/L作用72h后,MCF?7细胞PCNA、VEGF、bax、nm23蛋白的表达与细胞对照组相比差异有显著性（P<0.05），bcl?2蛋白质的表达与细胞对照组相比差异无显著性。

    3讨论

    ART是目前最有效一线抗疟药。Singh等[5]已证实ART对某些体外细胞有抑制增殖及杀伤的作用，如果将其应用范围扩展到肿瘤细胞的化疗上应当有重要的意义。

    实验结果表明，ART有明显抑制乳腺癌细胞生长作用，作用机制可能与下调PCNA、VEGF蛋白，上调bax、nm23蛋白的表达有关。

    PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，在DNA复制过程中起重要的调节作用，也是一种细胞周期调节蛋白，其表达随细胞周期而变化。PCNA表达量的增加同多种恶性肿瘤分化程度、组织学分级密切相关。如果PCNA在细胞中含量高而无p53表达，将出现DNA的复制，如果两者都表达，将产生DNA的修复效应，如果PCNA不表达、低表达或无功能，将发生凋亡[6]。故目前许多学者已把PCNA的阳性表达作为乳腺癌一个有用的预后指标[7]。本实验结果表明20μmol/L ART能明显抑制PCNA表达，从而降低DNA聚合酶δ的活性，抑制肿瘤细胞DNA的合成，这可能是ART抗肿瘤增殖作用的机制之一。

    研究表明，许多肿瘤均表达VEGF及其受体。由于VEGF在肿瘤血管生成方面的重要作用，它已成为阻断肿瘤血管形成的理想靶点和早期乳腺癌的独立预后因子[8]。Mattern等[9]认为VEGF不仅作为旁分泌因子可刺激血管内皮细胞增殖，同时还可能作为自分泌因子，通过直接作用于肿瘤细胞本身的VEGF受体而促进其生长。本实验发现，20μmol/L ART作用72h后，免疫细胞化学结果显示，MCF?7细胞中VEGF蛋白表达均下调，说明ART抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖还可能与其抑制VEGF表达，自分泌作用减弱有关，提示ART有潜在的抗血管生成活性[10]原癌基因bcl?2定位于第18号染色体，是一种膜整合蛋白，是细胞凋亡调控中最重要的基因，它能抑制细胞凋亡而使癌细胞长期存活，促进癌细胞克隆,并能诱导肿瘤细胞产生多药耐药性[11]，研究发现乳腺癌中有bcl?2表达。bcl?2抑制凋亡必须通过与bax形成异二聚体来实现。bax由192个氨基酸组成，21%的氨基酸与bcl?2同源，其生物学作用是拮抗bcl?2。bax的表达可抑制bcl?2的作用而启动癌细胞凋亡，两种蛋白的比例在诱导肿瘤细胞凋亡形成中十分重要。吴理茂等[12]在探讨ART诱导肝癌细胞发生凋亡机制的实验中指出ART抗肝癌作用机制可能为上调bax基因,下调bcl?2基因,诱导癌细胞凋亡,同时影响拓扑异构酶活性。本实验中，用药组较对照组，bax基因表达增加（ P<0.05），而bcl?2基因表达无显著性差异，bcl?2/bax比例下降。表明ART可影响bax基因的表达，从而诱导癌细胞凋亡，这也是ART抗肿瘤的机制之一。由于这两种基因参与调控诱导肿瘤细胞凋亡的是p53非依赖性途径，提示ART诱导肿瘤细胞凋亡与p53非依赖性途径有关。

    nm23编码的蛋白产物为核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK），它主要存在于细胞质和细胞膜上，是一个能催化多种反应具有复杂生物学功能的酶，主要通过影响微管装配，信号传导，转译调节及细胞粘附而维持细胞的正常分裂状态，从而抑制肿瘤细胞的转移[13]。本实验结果显示，ART可上调nm23的表达，说明ART可能具有阻止MCF?7细胞的远处转移，从而进一步抑制肿瘤细胞增殖的作用。

【】
［1］ 吴铃霓，黄真炎，雷娓娓，等.青蒿素诱导肝癌细胞凋亡的电镜观察［J］.新中医，2002,34(3):76?77.

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［13］Martin KK, Pilkington GJ.nm23,an invasion suppressor gene in CNS tumours? ［J］ .Anticancer Res，1998,18(2A):919?926.