雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究
作者：侯桂琴，鲁照明，穆 欣，刘洪涛，刘兰琦，许培荣，薛乐勋，王建人
【摘要】 ［目的］ 研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。［方法］ 采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子（p70S6K）在两细胞系中的表达，并采用RT-PCR和Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平测定此通路的活性。［结果］ mTOR在两种细胞系中均有表达，且在EC9706中的表达水平明显高于Eca109，mTOR下游靶点（p706S6K）的磷酸化水平也是EC9706明显高。 ［结论］ mTOR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关，细胞分化程度越低，通路的激活水平越高。
【关键词】 食管肿瘤 雷帕霉素靶蛋白 p70S6激酶 细胞株
Abstract: ［Purpose］ To study activation of mammalian target of rapamycin(mTOR) signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma cell lines EC9706 and Eca109. ［Methods］ The expression of mTOR and p70S6K in two esophageal squamous cell carcinoma cell lines was detected by immunocytochemistry; mRNA and protein levels were determined by Western blot analysis and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), respectively. ［Results］ There was expression of mTOR in both cell lines. The levels of mTOR and phosphorylated p70S6K expression in EC9706 were higher than those in Eca109. ［Conclusion］ mTOR signaling pathway is activated in the two squamous cell carcinoma cell lines and the status of activation correlates to differentiation of the cells, i.e. activated status is higher in poorly differentiated cells than that in well-differentiated cells.
Key words: esophageal neoplasms; mammalian target of rapamycin; p70S6K; cell lines
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是近年来发现的一种进化上保守的蛋白激酶，参与多种病理和生理过程，是细胞生长的中心调控因子。p70S6激酶（p70S6K）及4E-BP1是 mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，从而控制含5′-TOP结构的mRNA的翻译。mTOR信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，它所介导的信号传导通路的异常与多种恶性肿瘤有关，已成为肿瘤的新靶点[1]。食管鳞癌是我国的常见恶性肿瘤之一[2~4]，但有关食管鳞癌mTOR的研究在国内外尚未见报道。本文拟从RNA及蛋白水平验证mTOR/p70S6K信号通路在食管癌中的存在情况，为从分子水平治疗食管癌打基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
抗体及试剂：HRP标记羊抗鼠 IgG、S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；DNA Ladder分析试剂盒购自碧云天生物公司；mTOR、P70S6K抗体及p-P70S6K抗体购自美国Sant Cruze 公司；反转录试剂盒购自上海生工生物公司；Taq酶和dNTP购自大连宝生物；引物由上海生工生物公司合成。
细胞系：高分化食管鳞癌细胞系Eca109由本室保存，低分化食管鳞癌细胞系 EC9706由医学院肿瘤肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，阳性对照宫颈癌细胞系HeLa229购自中国科学院上海生物所细胞库。
1.2 方 法
细胞培养：三株细胞在含有10%的胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培养液（Gibco公司）中生长，并置于37℃，5% CO2的条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。
细胞爬片剂备及免疫细胞化学：将无菌处理的盖玻片均匀铺于六孔板中，接入细胞悬液，过夜培养使细胞达80%融合，吸出培养基，用PBS洗三遍，加入多聚甲醛固定20min，制成细胞爬片，然后按免疫组化试剂盒说明操作。mTOR与p70S6K抗体均1∶100稀释。
RT-PCR：Trizol法提取细胞总RNA并进行反转录。设计引物，RT-PCR法分析mTOR及p70S6K的表达。用Gentool进行灰度分析并统计学处理。
引物设计如下：mTOR：上游P1: 5′CGC TGT CAT CCC TTT ATC G 3′；下游P2：5′ATG CTC AAA CAC CTC CAC C 3′，长度为193bp。p70S6K：上游P1: 5′TAC TTC GGG TAC TTG GTA A 3′；下游P2：5′GAT GAA GGG ATG CTT TAC T 3′，长度为188bp。4E-BP1: 上游P1： 5′ACC GGA AAT TCC TGA TGG AG 3′；下游P2：5′CCC GCT TAT CTT CTG GGC TA 3′，长度为156bp。内参GAPDH: 上游P1: 5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA A-3′；下游P2：5′-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TTG-3′，长度为570bp。
Western blot：提取对数期生长细胞总蛋白，用考马斯亮蓝标准曲线法测蛋白浓度, SDS-PAGE电泳及Western blot分析细胞中mTOR、p70S6K和p-p70S6K表达，蛋白上样量均为50μg。mTOR、p70S6K及p-p70S6K抗体稀释浓度均为1∶200，两种抗均体为1∶5000稀释。mTOR转膜条件为湿转50m A，16 h；p70S6K和p-p70S6K转膜条件为半干转22V，100min，加一抗后4℃ 过夜。次日加二抗，室温下振摇1h，DAB染色。Western blot 操作步骤《分子克隆操作指南》。
1.3 统计学分析
统计学处理在SPSS13.0上完成。数据以x±s表示；进行单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05差异有显著性。RT-PCR及Western blot结果的灰度值分析分别采用BandScan5.0和TotolLab2.0软件完成。
2 结 果
2.1 mTOR及p-p70S6K在食管癌细胞系EC9706和Eca109中的细胞免疫组化
与Hela229细胞相比，在两种食管癌细胞株EC9706和Eca109中mTOR和p-p70S6K均呈阳性，说明食管癌细胞中mTOR和p-p70S6K均为高表达。
2.2 Western blot
从Western blot 结果可以看出，两种细胞株中mTOR及p-p70S6K均有较强的表达，而p70S6K表达相对较弱（图1）。由于磷酸化的p70S6K比其非磷酸化状态的翻译活性要高约100倍，说明在两种细胞株中均存在mTOR信号传导通路的激活。
从表1看出，mTOR在EC9706及Eca109中的表达有明显差异(F=34.80，P<0.05)；p-p70S6K在两种细胞株中的表达也有明显差异(F=56.29，P<0.05)，表明两种细胞株中mTOR及p-p70S6K表达水平不同，在EC9706中的表达水平明显高于Eca109。
2.3 RT-PCR结果
从RT-PCR结果可以看出，mTOR mRNA在两种细胞株中也均有表达（图2A，表2），统计发现，两种细胞株中mTOR mRNA的表达有明显差异(F=13.85，P<0.05)，且在EC9706中的表达明显高于Eca109。而mTOR 的两个下游重要靶分子p70S6K和4E-BP1在两种细胞株中的表达也有差异(P<0.05)，在EC9706中的表达水平明高低于Eca109（图2B、C，表2）。
3 讨 论
近年来的研究证实，mTOR信号通路在恶性肿瘤形成中起重要作用，已成为肿瘤的新靶点[5，6]。mTOR是G1细胞周期蛋白合成的核心调控者，在正常的细胞生长增殖中起到主要作用，而且与细胞分化以及癌细胞的生长、增殖密切相关[7]。mTOR在多种肿瘤中被显著激活，并且mTOR可直接使p70S6K中 Thr389磷酸化（p-p70S6K），p-p70S6K促翻译活性高出未磷酸化p70S6K 100倍左右，从而促进蛋白合成[8]，使细胞周期停滞促进细胞凋亡产生[9]。本试验以低分化的EC9706和高分化的Eca109两种食管癌细胞株为研究对象，通过细胞免疫化学、Western blot及RT-PCR首次证实了食管鳞癌细胞中存在高活性的mTOR，并且在EC9706中无论是mRNA还是蛋白水平均高于Eca109，即细胞的分化程度越低，肿瘤的恶性程度越高，mTOR的激活水平越高；而mTOR下游的重要靶点p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平越高，从而使细胞中蛋白合成越快，即细胞生长越快，这又进一步加速了细胞的恶化。本研究结果说明了mTOR 信号通路的激活在食管癌发生中的重要地位。
致谢：本研究在郑州大学河南省分子医学重点学科开放实验室完成。
【】
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