靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定
【摘要】 ［目的］ 构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。［方法］ 针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。［结果］ 酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA 表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。［结论］ 成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因的研究提供实验基础。
【关键词】 细胞周期蛋白E 短发卡结构状RNA RNA干扰
Construction and Identification of shRNA Expression Vector Specific for Cyclin E
Abstract: ［Purpose］ To construct the short hairpin RNA （shRNA） expression vector specific for cyclin E. ［Methods］ Oligonucleotides were designed specific for cyclin E gene, after annealing the formed double-stranded DNAs were ligated with Psilencer2.1-U6-neo. The expression vectors of Psilencer2.1-U6/shRNA were identified by enzyme digestion and sequence analysis and transfected into MCF-7 cells. The expression of cyclin E was analyzed by Western blot. ［Results］ The vector was identified by restriction enzyme digestion and sequence analysis, the expression vectors of Psilencer2.1-U6/shRNA was successfully constructed. The expression of MCF-7 cells cyclin E expression level was suppressed after transfection with cyclin E shRNA vector. ［Conclusion］ The Psilencer2.1-U6/shRNA specific for cyclin E is successfully constructed and it will provide experimental basis for cancer gene therapy by RNAi technique.
Key words: cyclin E; short hairpin RNA; RNA interference 肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞生长周期的失调在肿瘤的发生中起关键作用。Cyclin E高表达可以缩短G1期，引起中心体过增殖，扰乱有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而诱发肿瘤[1]。已有研究提示，cyclin E在白血病、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种肿瘤中过表达[2]，因此，cyclin E有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是一种能阻断目的基因表达的有效方法[3]。本研究设计了靶向cyclin E的短发卡结构状RNA (short hairpin RNA，shRNA)，利用载体质粒Psilencer2.1-U6-neo构建产生shRNA，为今后将其进一步应用于cyclin E的靶向治疗研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
DMEM培养基、胰蛋白酶、E.coli DH5α、脂质体转染试剂LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT (Invitrogen)、胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，鼠抗人cyclin E多克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG为Santa cruz公司产品、Supersignal West pico Trial Kit为PIERCE公司产品，小量质粒提取试剂盒（中鼎公司）、Psilencer2.1-U6-neo表达载体（Ambion公司），T4 DNA Ligase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ（NEB公司），MCF-7细胞株（浙江大学医学院病理教研室惠赠），半干转膜仪（BIO-RAD）。
1.2 实验方法
1.2.1 shRNA表达载体的构建
分别合成编码发夹结构shRNA的正义链和反义链，结构如下：BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ，针对cyclin E基因的序列为：P1:5′-GATCCGATTTCTTTGACCGGTATATTCAAG-
ACGTATACCGGTCAAAGAAATCTTTTTTGTCGACA -3′，P2:3′-GCTAAAGAAACTGGCCATATAAGTTCTG-
CATATGGCCAGTTTCTTTAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，对照shRNA的序列为：P1:5′-GATCCGACTT-
CATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCT
TATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3′，P2 :3′GCTG-
AAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACG-CGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′。
分别取2ml 正反义寡核苷酸(终浓度均为25mmol/L)，16ml退火缓冲液(200mmol/L NaCl，20mmol/L Tris)，94℃水浴5min，然后冷却至室温。将退火后的双链siRNA模板与Psilencer2.1-U6-neo质粒表达载体于16℃连接过夜。以连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。从每个培养皿上各挑取3个单菌落接种于3ml含Ampr抗性（终浓度为50mg/ml）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用试剂盒小量提取质粒，并分别用SalⅠ做酶切鉴定。收集酶切鉴定正确的重组质粒，进行DNA测序。
1.2.2 细胞培养及siRNA转染
MCF-7细胞培养体系为含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养。转染24 h前，传代至6孔培养板，每孔2.5×105个细胞。实验分空白组、对照组和siRNA实验组。空白组不经任何处理，对照组转染阴性对照shRNA表达载体1μg，实验组转染shRNA-cyclin E表达载体1μg。用LIPOFECTAMINE 2000脂质体转染试剂进行转染，于37℃、5%CO2 转染48h后，收获细胞。
1.2.3 Western Blot检测cyclin E蛋白表达
收集转染的细胞，加细胞裂解液(1% NP40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1mmol/L PMSF，100mmol/L Leupeptin，1mmol/L Na3VO4)裂解，10kg×10min离心收集上清液，Bradford法测蛋白含量。取25μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜（BIO-RAD半干转膜，24V、24 min），鼠抗人cyclin E(1∶1 000)，二抗(1∶7 000)，Supersignal West pico Trial Kit显色。同时检测Actin蛋白表达，作为内参照。
2 结 果
2.1 shRNA重组质粒的构建及鉴定
将提取的质粒用SalⅠ做酶切鉴定。经酶切鉴定：质粒Psilence2.1-U6-neo序列里面是没有SalⅠ的酶切位点的，而在我们的插入序列里面设计了SalⅠ的酶切位点，如果插入正确，就应该能够被SalⅠ所酶切；而重组质粒能被SalⅠ酶切，即为插入正确的质粒。测序结果显示，特异性针对cyclin E的 shRNA载体构建成功。见图1、2。
2.2 siRNA转染后cyclin E蛋白表达的变化
shRNA-cyclin E表达载体转染48h后，分别提取转染shRNA-cyclin E和对照shRNA表达载体的细胞总蛋白做western blot分析。与对照组相比，转染shRNA-cyclin E后，cyclin E蛋白表达明显降低。
3 讨 论
RNAi是最近起来的一种抑制特定基因表达的新方法，在基因组功能分析领域已经成为强有力的工具，并且随着在哺乳动物细胞内的进一步应用，人们已经开始关注RNAi作为一种基因手段的潜力。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ启动子下游。与直接导入化学合成的siRNA相比，这种技术由于涉及到克隆，这个过程需要较长时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的，但是操作简便，成本低，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高[6]。另外我们选择的Psilencer2.1-U6-neo真核表达载体带有neo的选择标记，通过G418抗生素筛选，能筛选出表达shRNA的细胞，用于长期的基因功能研究。
Cyclin E是一种细胞周期蛋白，在G1/S期的过渡时期进行积累，调控细胞进入S期，之后被泛肽介导的蛋白酶解途径降解。如果cyclin E的降解途径发生缺陷的话，就会导致细胞进入S期加速，细胞的遗传就会不稳定，以致发生癌变。大量研究表明cyclin E在肿瘤的发生中起到重要作用,也能为大量常见的肿瘤提供预后信息[7，8]，同时cyclin E高表达也是肿瘤耐药的机制之一[9]。本实验以cyclin E为靶标，设计siRNA序列，并构建其表达质粒Psilence2.1-U6表达shRNA-cyclin E，酶切和测序结果显示，特异性针对cyclin E的 shRNA载体构建成功；转染乳腺癌MCF-7细胞后，使cyclin E表达明显下降，成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为RNAi在肿瘤cyclin E靶向基因治疗研究，提供了重要实验基础，我们也将进一步利用cyclin E的shRNA载体，进行肿瘤基因治疗的体内外实验。
【】
[1] Spruck CH, Won KA, Reed SI. Deregulated cyclin E induces chromosome instability[J]. Nature, 1999, 401(6750):297-300.
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[5] Deshpande A, Sicinski P, Hinds PW. Cyclins and CDKs in development and cancer: a perspective[J]. Oncogene, 2005, 24(17): 2909-2915.
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