透明质酸寡糖逆转MCF?7/ADM耐药及促凋亡作用研究

               作者：王丽萍　王宝中　司海运　赵春亭　隋振霞 

【摘要】  　　［目的］ 研究透明质酸寡糖逆转MCF?7/ADM细胞耐药的作用。［方法］ MTT法研究透明质酸寡糖对MCF?7/ADM耐药逆转作用，流式细胞术测定细胞表面耐药相关蛋白P?gp、MRP的表达及凋亡调控蛋白p53、bcl?2的表达。［结果］ 透明质酸寡糖可提高MCF?7/ADM对化疗药的敏感性，使P?gp、MRP表达下降，p53表达增高。［结论］透明质酸寡糖可部分逆转MCF?7/ADM耐药及促进凋亡的作用。

【关键词】  透明质酸寡糖　MCF?7/ADM　逆转耐药　凋亡

　　肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性是肿瘤失败的重要原因，克服多药耐药性的方法之一是使用逆转剂[1，2]。目前虽已找到许多逆转多药耐药的药物，但是，或由于效果不够满意，或其毒副作用较大，很难在临床推广。本实验利用人乳腺癌耐阿霉素细胞系，以MTT法、流式细胞术，研究透明质酸寡糖（hyaluronate oligomers，oligo?HA）对耐药细胞的增敏及耐药逆转作用，并从降低膜表面转运蛋白表达，促进耐药细胞凋亡的角度探讨其逆转耐药的机制，以期能寻找到逆转MDR作用强、毒性小的药物。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    乳腺癌MCF?7/S敏感细胞及对阿霉素耐药MCF?7/ADM细胞，源于医学院天津血液病研究所。细胞培养于IMDM培养液中，含10％胎牛血清，试验用对数生长期细胞。PE?P?gp单抗、PE?MRP单抗、FITC?bcl?2单抗、FITC?p53单抗，均为美国Biosciences Pharmingen产品；oligo?HA（M.W.2500Da）和MTT分别为Seikagaku公司、Sigma公司产品。 EL340i型酶联免疫仪，美国Biotok公司；FACSCaliber型流式细胞仪，美国BD公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养及实验分组

    取对数生长期的MCF?7／ADM细胞系，均随机分为实验孔和对照孔，各组实验孔和对照孔分别设6个复孔，每组实验重复3次。其中实验孔加入不同浓度（50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml）的透明质酸寡糖（以下均用HA1、HA2和HA3表示）。对照组不加任何试剂或加等体积的培养液。各实验孔细胞均与oligo?HA共培养48h后，收集并进行以下各试验。

    1.2.2 oligo?HA对MCF?7／ADM的耐药逆转作用

    将上述经oligo?HA作用后的实验组细胞和对照组细胞收集后，以5×104接种于96孔板中，每孔190μl 37℃ 5% CO2、饱和湿度的条件下培养24h，然后加入不同浓度梯度的抗癌药物（另设空白对照孔及调零孔，每浓度设6个复孔）。在培养箱里让细胞与药物作用48h。每孔加入10μ1的MTT，继续培养3h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，振荡使甲瞻晶体充分溶解后，用酶标仪(波长490nm)检测OD值；然后各组的细胞存活率、死亡率及耐药逆转倍数。

    细胞存活率=实验组OD／对照组OD×100％

    细胞死亡率=(1-实验组OD／对照组OD)×100％

    耐药逆转倍数=逆转剂加抗癌药物组细胞死亡率／抗癌药物组细胞死亡率

    1.2.3 oligo?HA对细胞内药物积累分析

    分别向上述实验孔和对照孔细胞中加入终浓度为10μg／ml的阿霉素。在原细胞培养条件下，继续培养3 h,经流式细胞仪检测细胞内ADM的相对荧光强度。

    1.2.4 膜表面耐药相关蛋白P?gp表达测定

    收集上述培养的各组实验孔和对照孔细胞并调节浓度为1×106／ml，加入PE标记的P?gp抗体20μl，37℃避光胞膜染色30min，流式细胞仪检测平均荧光强度。

    1.2.5 凋亡调控蛋白bcl?2、p53表达测定

    细胞培养及实验分组同上，分别加入FITC标记的bcl?2及p53抗体20μl，流式细胞仪检测平均荧光强度。

    1.2.6 统计方法

    采用SPSSl0．0软件包进行统计学处理。数据用均数±标准差(x±s)表示，计量资料用配对t检验，以P<0．05作为显著界限。

    2 结 果

    2.1 oligo?HA增强耐药细胞对阿霉素的敏感性

    不同浓度oligo?HA均能明显增加耐药细胞MCF?7/ADM对ADM的敏感性，增加耐药细胞死亡率，与对照组比较差异有显著性(P<0．05)，增敏倍数分别为1.48、2.04、1.89;另外，MCF?7/ADM与MCF?7/S 组间各细胞死亡率比较，差异亦均具统计学意义(P<0．05) (见表1)。

    2.2 oligo?HA增加胞内ADM蓄积

    流式细胞仪检测104个耐药细胞内ADM的相对荧光强度，HA1+ADM、HA2+ADM、HA3+ADM组荧光值分别为15.78±1．19、19.34±0．65和19.57±1．61；相同培养基的MCF?7/ADM中直接加ADM组（对照组）荧光值为12．68±0．54。结果表明，三组均能明显增加ADM在细胞内含量，使ADM胞内积累增加1．21、1.44和1．43倍，与对照组比较有显著性意义(P<0．05)；另外， HA2 、HA3剂量组间未显示有明显的差异(P>0．05)；HA1 与另两组比较差异有统计学意义(P<0．05)。

    2.3 oligo?HA对耐药相关蛋白及凋亡调控蛋白的作用

    见表2。与对照组细胞比较，各浓度oligo?HA均能明显降低膜表面P?gp、MRP表达(P值均<0．05)，其中，HA2与HA3组间未显示有明显的差异(P>0．05)。另外，HA2、HA3浓度组均可上调凋亡调控蛋白p53表达(P值均<0．05)；且各组均对bcl?2表达无明显作用(P>0．05)，说明各浓度oligo?HA均有一定程度降低膜表面耐药蛋白表达及促耐药细胞凋亡的作用。

    3 讨 论

    目前研究已证实，P?gp高表达是肿瘤细胞多药耐药的发生机制之一，P?gp是一种能量依赖性药物排出泵，通过ATP供应能量，可将抗肿瘤药物由细胞内泵出，使其细胞毒作用减弱或消失，而导致化疗失败。最近，研究人员发现先前被认为在细胞中起到结构性和惰性作用的透明质酸，事实上是引发癌细胞抗药反应的关键物质，透明质酸能和其受体蛋白CD44结合，与磷酸肌醇?3激酶一起，促使癌细胞增加生成，能把药物运输出细胞的蛋白质如P?gp，从而使癌细胞产生抗药性[3，4]。癌细胞中透明质酸的量越多，抗药性就越强。因此如果能够阻断这一环节，可能增敏化疗药物抗性的癌细胞对化疗药物的敏感性。多糖低聚物或单抗能与透明质酸的一个受体CD44结合并阻止它启动一种可能导致药物抗性的信号级联，从而逆转耐药。

    另有报道，肿瘤细胞多药耐药的发生机制涉及肿瘤抑制蛋白p53的失活，诱导耐药细胞的凋亡可能对改善耐药细胞的对药性有一定作用[5，6]。bcl?2和p53均为凋亡调控蛋白，bcl?2抑制肿瘤细胞凋亡，p53促进肿瘤细胞凋亡。因此， p53表达上调或bcl?2下调，均能促进肿瘤细胞凋亡而达到一定程度逆转耐药的作用。本实验从阻断信号传导和促进凋亡两方面来研究oligo?HA对耐药细胞系逆转耐药的作用，为临床应用提供理论基础。

    我们的研究表明透明质酸寡糖的干预能增强化疗药ADM对MCF?7/ADM的敏感性，使ADM对耐药细胞的杀伤性增大，并可增加胞内化疗药物浓度，以逆转MCF?7/ADM细胞的耐药性。同时发现随着透明质酸寡糖浓度(50μg/ml～150μg/ml)的增大，耐药肿瘤细胞死亡率逐渐增高，且胞内阿霉素的浓度亦增多，逆转能力逐渐增强。另外，我们发现经过处理后的耐药细胞，耐药蛋白P?gp、MRP的表达率明显降低；透明质酸寡糖浓度在50μg/ml时p53的表达无明显上调，但随浓度的提高，p53表达明显上调。从而提示透明质酸寡糖可能通过抑制MDR蛋白的表达、调控凋亡蛋白来逆转细胞对ADM的耐药，且上调凋亡蛋白的透明质酸寡糖浓度应大于50μg/ml。

    综上所述，临床应用透明质酸拮抗剂如小分子的透明质酸寡糖能够逆转癌细胞药物抗性。我们可以设想将这种透明质酸拮抗剂与化疗相结合，可能会达到更好的效果。

【文献】
  [1] Gottesman MM． How cancer cells evade chemotherapy: Sixteenth Richard and Hinda Risenthal foundation award lecture[J]. Cancer Res,1993，53(4)：747-751．

[2] Steller H．Mechanistns and genes of cellular suicide[J]．Science, 1995, 267（5203）：1445-1449．

[3] Misra S,Ghatak S,Zoltan?Jones A, et al. Regulation of multidrug resistance in cancer cells by hyaluronan[J]. J Biol Chem,2003,278(28):25285-25288.

[4] Suniti Misra， Shibnath Ghatak, Bryan P Toole. Regulation of MDR1 expression and drug resistance by a positive feedback loop Involving hyaluronan, phosphoinositide 3?Kinase, and ErbB2[J]. J Biol Chem, 2005, 280(21): 20310-20315.

[5] 刘冰冰, 粱仁, 杨世杰． 二十五碳五烯酸体外逆转人乳腺癌细胞株耐药性的研究[J]．实用肿瘤杂志，2002，17(2)：18l-183．

[6] Kataoka S, Naito M, Tomida A, et a1． Resistsnce to antitumor agent?induced apoptosis in a mutant of human myeloid leukemia U937 cells[J]． Exp Cell Res,1994，215（1）：199-205．