广州地区汉族人群肺癌易感性标记物CYP1A1、CYP2E1和GSTM1与肺癌关系的病例对照研究
作者：王德全 陈思东 汪保国 蔡旭玲 冼雪珍
【摘要】 ［目的］ 探讨广州地区汉族人群谷胱苷肽硫转移酶（GSTM1）、细胞色素P450 1A1 （CYP1A1）和细胞色素P450 2E1（CYP2E1）基因多态性与肺癌易感性的关系。［方法］ 选取中山大学附属第一、广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院等医院的广州籍新发肺癌病人91例及同期上述各医院的同性别非肺部疾患病人91例作对照，采用聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测CYP1A1、CYP2E1和GSTM1的基因多态性。［结果］ 与野生型 的CYP1A1相比,突变型肺癌OR为1.51 (0.76～3.01), CYP2E1 C2C2基因型与C1C1基因型比较，其OR为5.48(1.21～25.23)，GSTM1基因缺失型的OR值为1.26（0.69～2.30），而三者联合作用时，则可增加患肺癌的危险，其OR值为3.97(0.94～16.79)，但无统计学意义（P>0.05）。［结论］ CYP1A1、CYP2E1 和GSTM1的某些基因型增加了患肺癌的危险性，但尚未达到统计学的显著性水平,说明它们均不是肺癌个体易感性的主效基因，而是次效基因。
【关键词】 基因多态性 肺肿瘤 病例对照研究
1 材料与方法
1.1 研究对象
病例来源于广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院、中山大学附属第一医院等2000年至2001年广州籍新发肺癌病人91例，其中男性60例，女性31例。年龄22岁~84岁。对照组1：1匹配来源于同期同一医院非肿瘤非肺部疾患的病人，性别相同，年龄±2岁。对照组91例，其中男性60例，女性31例，年龄最小22岁， 最大82岁。两组间的年龄和性别的分布差异无显著性。
1.2 样本的采集
采集实验对象的静脉血8ml~10ml，于4℃冰箱静置分离血清及血凝块，取血凝块于-70℃冰冻保存。
1.3 DNA的制备
新鲜血凝块或冰冻血凝块室温解冻后，采用DNA酚抽提方法提取DNA。
1.4 CYP1A1基因型的检测
引物序列：5′?鄄CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT?鄄3′和：5′?鄄TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT?鄄3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PCR反应体积及反应条件：ddH2O 8.5μl，10×Buffer 5.0μl，dNTPs 1.0μl(0.01μmol)，引物2种各10.0μl（3.125×10-5μmol）(0.655μM)，Taq酶0.5μl（2.5U），模板5.0μl。94℃预变性2min，然后用94℃50s（变性）、54℃50s（退火）、72℃60s（延伸），进行30个循环，最后72℃7min。PCR扩增产物用MSPI酶切：扩增产物10μl，（10U）MsPI内切酶1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 2μl 1000g，离心数秒，加石蜡25μl，37℃水浴1~3h，65℃水浴10~15min终止酶切，取8μl酶切产物点样用1.8 %琼脂凝胶作电泳分析。
结果判断：野生型为340bp，突变型140，200 bp 2个片段，杂合型为140，200，340bp 3个片段。
1.5 CYP2E1基因多态性检测
引物设计：CYP450 2E1 PstI/RsaI型引物：5′?鄄CCAGTCGAGTCTACATTGTCA?鄄3′，5′?鄄TTCATTCTGTCTTCTAACTGG?鄄3′。
PCR反应条件：ddH2O 8.5μl，10×Buffer 5.0μl，dNTPs 1.0μl(0.01μmol)，引物4种各10.0μl（3.125×10-5μmol）（0.655μM），Taq酶0.5μl（2.5U），模板5.0μl。94℃预变性2min，然后用94℃50s（变性）、54℃50s（退火）、72℃60s（延伸），进行30个循环，最后72℃7min。PCR扩增产物的酶切: 总体积15μl：扩增产物10μl，（10U）RsaI内切酶1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 2μl 1000g，离心数秒，加石蜡25μl，37℃水浴1~3h，65℃水浴10~15min终止酶切，取8μl酶切产物点样用1.8%琼脂凝胶作电泳分析。
结果判断：PCR产物长度为410bp，经RsaI酶切后，在紫外光下可见三种情况：①出现360bp和50bp的两条亮带，此为C1C1野生型纯合子；②只出现410bp的亮带，此乃C2C2突变型纯合子；③若出现上述的全部三条亮带，此为C1C2杂合子。
1.6 GSTM1基因多态性检测
两对引物（见表1）分别特异性扩增GSTM1基因片断（215bp）及参照基因β?鄄globin（β?鄄珠蛋白、268bp），由上海生物工程公司合成。
1.6.1 PCR扩增
ddH2O 18.5μl，10×Buffer 5.0μl， dNTPs 1.0μl(0.01μmol)，引物4种，各10.0μl（3.125×10-5μmol），Taq酶 0.75μl（3.75U），模板5.0μl。94℃预变性2min，然后用94℃50s（变性）、54℃50s（退火）、72℃60s（延伸），进行30个循环，最后72℃7min。
1.6.2 琼脂扩电泳检测
取10μl反应物加样于1.8%琼脂扩凝胶，电泳30min，1%溴化乙锭（EB）染色，紫外光下可见PCR扩增的相应大小DNA片段的荧光带，即可判定结果。
1.6.3 结果判定
扩增产物分为2个基因型，GSTM1（+）紫外光下可见2条电泳带，即268bp和215bp，GSTM1（-）仅可见268bp带。
1.7 数据统计分析
所有资料以FOXPRO建立数据库，用SAS6.12软件包进行统计分析。
2 结 果
2.1 CYP1A1基因型与肺癌风险关系分析
MSPI识别的CYP1A1基因有三种类型，即突变型（纯合子）、杂合型、野生型。它们在病例组的携带率见表2。
2.2 CYP2E1基因多态的频率分布及与肺癌风险关系
本研究检测了182人，其中C1C1基因型者114人（62.64%），C1C2者59人（32.42%），C2C2型9人（4.95%），其中病例组与对照组的频率分布见表3。杂合型变异的危险性最小，以其为参照组与两种纯合型比较进行肺癌风险的分析（表3）。
2.3 GSTM1基因多态性与肺癌风险的关系
GSTM1等位基因型在病例和对照组中的频率分布见表4。如果以常见的GSTM1阳性（+/+，+/-）基因型个体的OR为1，基因缺失个体的OR值为1.26（95%CI：0.69～2.30）。
2.4 CYP1A1、GSTM1基因多态联合作用与肺癌风险
CYP1A1基因型与GSTM1基因多态的联合作用与肺癌风险的关系分析结果见表5。以上结果表明，当CYP1A1 为突变型且GSTM1 缺失时，发生肺癌的风险较大，OR为2.29，但经统计学检验差异无显著性（P>0.05）。
2.5 CYP2E1与GSTM1联合作用与肺癌风险
由于C2C2型例数较少，将其合并至C1C2也不合理，因此，只是比较C1C1和C1C2与肺癌风险的关系。结果表明GSTM1缺失型且携带CYP2E1 C1C1基因型者患肺癌的风险为GSTM1正常型的携带CYP2E1 C1C2者的2.13倍（95%CI：0.82~5.56）（见表6）。
2.6 CYP1A1基因型与CYP2E1基因型联合作用与肺癌风险关系
由表7可见，突变型CYP1A1且具有C1C1的CYP2E1基因型者，患肺癌风险明显增大，OR为3.00(95%CI：1.03～8.78)，经统计学检验，差异具有显著性(χ2=4.0191，P<0.05)。
2.7 CYP1A1、CYP2E1、GSTM1基因型联合作用与肺癌风险关系
由表8可见，当CYP1A1为突变型、CYP2E1为C1C1型且GSTM1为缺失型基因型者肺癌的风险最大，OR为3.97。
3 讨 论
人类CYP1A1基因位于第15号染色体（q22?鄄qter）上，CYP1A1是一种肝外酶，在肺组织主要与多种化学物的代谢有关[１]。本研究结果提示，广州地区汉族人群CYP1A1 C型基因（突变型基因）频率为39.56%，该突变率是目前国内同类研究中最高的，这与广州为全国肺癌高发区分布相一致，提示广州可能存在更多的导致肺癌发生的环境危险因素。但迄今还不清楚，这些CYP1A1 C型基因是先天遗传的还是后天的暴露刺激所产生的。
CYP2E1 基因定位于人的第10号染色体上，CYP2E1是外源性化学物质的活化酶，能催化许多物质的氧化还原反应，特别是亲水性小分子化合物，在化学致癌中，代谢激活各种癌前物质活性与癌症发生可能有一定关系。CYP2E1多态性最常见的是5′区的Pstl/Rsal多态和内含子6的Dral多态。这种多态性差异的原因可能是遗传、环境因素或两者同时作用的结果[２]。
本次研究Rsal识别的CYP2E1等位基因有三种多态，即C1C1、C1C2和C2C2 型，C1C2杂合型变异发生肺癌的风险最小，而与C1C2杂合型比较，C2C2 基因型增加肺癌风险性，OR为5.48（95%CI：1.21~25.23，P<0.05）。
人谷胱甘肽?鄄S?鄄转移酶基因位于第一号染色体上，GSTM1是一种解毒酶，它与许多遗传毒物的代谢密切相关，遗传毒物可与DNA结合成DNA加合物，引起细胞遗传物质损伤及诱发肿瘤等。本次研究发现广州地区汉族人群病例组GSTM1缺失率高达61.54%，但与对照组比较差异无显著性（P>0.05），该结果与国内类似的研究报告不同，造成这种不同的原因很可能是不同地区环境因素差异所致。
在单一易感基因的分析中，经常可以见到易感基因与肺癌风险之间无关联的结果，说明单一易感基因多态性与肺癌的关系是微弱的。但是不能根据这种无相关性或微弱的联系就否定它们在肺癌发生中的作用。目前认为肿瘤的形成是环境因素和遗传因素相互作用的结果，是一种由多个基因及环境因子综合引起的复杂病，其主要特点是：①参与发病的遗传因素可能达数十个，每个基因直接或间接地参与肿瘤的发病。②每个基因参与发病的程度不同，大多数基因的作用较小或是微效的，称之为次效基因。但可有一个或几个基因的作用呈明显的主效效应，此为主效基因。③每个基因只赋予个体某种程度的易感性， 没有其它基因或环境因素的参与，个体存在的单个易感基因并不一定致病，亦非致病所必需。④各基因参与发病的机制可以是各自对不同生物学途径影响所致，即异质性。亦可以是对同一或相关生物学途径各自发生正性或负性相互作用综合影响结果。⑤各基因致病效应之积累加上环境因子的作用构成个体的癌症的易患性。目前对肺癌易感基因（CYP450S和GSTMS）的研究均未发现主效基因，我们所研究的CYP1A1，CYP2E1和GSTM1均未显示出对肺癌发病的主效效应，都是属于次效基因，对这种次效基因的危险性的评价，必须进行多种基因的联合作用的观察才能较为准确估计。
Ⅰ相代谢酶（如P450）、Ⅱ相代谢酶（如GSTM）。与机体对环境中的化学致癌物、致突变物的易感性密切相关[３~５]。因此，在决定某一化学物代谢酶多态性与肿瘤易感性的关系时，不仅要考虑它的单独作用，更要考虑它们的联合作用。CYP1A1基因多态性与GSTM1基因多态性的联合研究结果表明，携带CYP1A1突变型基因而GSTM1缺失者，患肺癌的风险为2.01（0.86～4.68）。GSTM1缺失并携带CYP1A1突变型基因和CYP2E1 C1C1基因者比GSTM1缺失携带CYP1A1突变型，CYP2E1 C1C2基因者，其肺癌的风险为3.68，说明多种基因的联合作用明显增加了个体患肺癌的危险性。同时也说明CYP2E1 C1C1是本研究人群中的肺癌风险的主要危险因素，而C1C2型似乎有保护作用。
【】
[1] 陶厚权，王瑞年.DNA修复障碍、基因组不稳定性与癌症[J].肿瘤,2003,12(2):101-106.
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