抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

             作者：胡廷辉　应敏刚　郑秋红　龚福生　谢云青

　树突状细胞（dendritic cell，DC）是已知功能最强的抗原呈递细胞，是机体T淋巴细胞特异免疫应答的直接启动和调控者，在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。在体外培养DC并用肿瘤抗原致敏后，携带肿瘤抗原信息的DC，在体内外激活针对该肿瘤细胞的特异性杀伤细胞。本试验在体外用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC后诱导CIK，通过其对SGC的杀伤作用的研究为DC胃癌的研究提供理论及试验依据。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂

    SGC由福建省肿瘤分子生物学研究室提供；rhIL?鄄2、rhIL?鄄4、CD3 mAb购自Peprotech公司；rhGM?鄄CSF、Ficoll淋巴细胞分离液购自军事医学院；胎牛血清(超级)购自杭州四季青生物制品公司；人AB血清由福建省血液中心提供；1640培养基购自Gibco公司；FITC标记的小鼠抗人CD83、HLA?鄄DR、CD14、CD86及同亚型对照抗体购于晶美生物工程有限公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 SGC的培养

    SGC在5％CO2、37℃条件下，用含有10％胎牛血清RPMI1640培养液常规培养。

    1.2.2 肿瘤细胞总蛋白的获取

    将培养贴壁肿瘤细胞用胰酶消化悬浮，离心弃上清，用无血清RPMI1640培养液重悬，超声破膜，30 000r/min超速离心90min，取上清。浓缩透析，调整蛋白浓度为25mg/ml，经0.22μm滤膜滤过除菌，－80℃保存。

    1.2.3 DC的培养[1]

    无菌条件下采集的正常人抗凝外周全血，经淋巴细胞分离液梯度离心，获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，调整细胞浓度至5×107/ml，加1ml至6孔板内培养箱中培养2h，吸掉上清，用培养液洗去非黏附细胞，获得贴壁细胞，每孔再加入3ml 含有rhIL?鄄4 （500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培养液，2~3d半量换液1次。

    1.2.4 抗原负载DC及表型鉴定

    将上述培养5d的DC 用含有rhIL?鄄4 （500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml，向6孔板内加入2ml的细胞，每孔加入肿瘤细胞总蛋白1ml（25mg），于第8d收集悬浮细胞为抗原致敏的DC。对照组加入无血清RPMI1640培养液1ml，于第8d收集悬浮细胞为空白的DC。分别收集第1d、第5d及第8d抗原致敏的DC，用流式细胞仪检测DC表面分子HLA?鄄DR、CD83、CD86、CD14表达。

    1.2.5 CIK的培养[2]

    同前法从外周血中获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养2h，取悬浮细胞，调整细胞数为1×106/ml，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液培养，2~3d半量换液1次至第8d。试验组用将其分别与空白的DC及抗原致敏的DC 按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb( 50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。对照组仅用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。5d后分别获取抗原致敏DC诱导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK为效应细胞。

    1.2.6 混合淋巴细胞反应（MLR）

    试验组收集成熟经抗原致敏及空白的DC，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)10%AB血清的RPMI1640调整细胞数为1×106/ml。收集同时期培养的CTK用同样的培养液调整细胞数为1×107/ml。将100μlCIK分别与100μl经抗原致敏及空白的DC在96孔培养板中混合培养。对照组100μlCIK加入100μl含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb 50μg/L10%AB血清的RPMI1640继续培养。72h后加入四甲基偶氮唑蓝（MTT）10μg，继续培养4h，离心弃去孔内上清，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm处测OD值（A），每组设3个复孔，取均值按下式：

    刺激指数SI=A实验孔/A对照孔×100％

    1.2.7 细胞杀伤试验

    用MTT比色法测定抗原致敏DC诱导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK对SGC细胞的杀伤活性，效靶比为5：1、10：1、20：1。调整细胞至所需浓度，各取100μl的效靶细胞悬液加入96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，加入四甲基偶氮唑蓝（MTT）10μg，继续培养4h，离心弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm处测OD值， 同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔设3个复孔，取其均值按下式计算：

    CIK细胞毒性（％）＝[1－（A效+靶－A效）/A靶]×100%

    1.3 统计学方法

    采用SPSS10.0软件对数据进行析因分析及t检验。

    2 结 果

    2.1 DC形态学的观察

    从外周血获得单个核细胞，培养2h，获得贴壁细胞，多为体积小、圆形的单个核细胞。5d时可见细胞伸展体积变大，形状不规则，部分细胞悬浮。经抗原致敏后第8d时可见大部分细胞悬浮，变大并伸出伪足，细胞内可见大量的颗粒，倒置相差显微镜下可见毛刺状突起，为典型DC形态。

    2.2 抗原负载前后DC表型的变化

    用流式细胞仪检测DC表面分子HLA?鄄DR的表达第1d为5.01％、第5d为28.21％、第8d为62.01％。CD83分别为1.03％、4.50％、15.57％。CD86分别为4.47％、25.75％、41.03％。CD14分别为13.02％、3.26％、0.55％。

    2.3 混合淋巴细胞反应

    显微镜下观察，两种细胞共培养过程中，可见DC细胞逐渐减少，72h后视野中已不存在DC。两试验组及对照组CIK细胞数均较72h前明显增多。混合细胞培养亦显示：抗原致敏的DC与空白的DC都具有很强的刺激CIK细胞增殖的能力，分别是细胞因子刺激能力的3.12倍和3.09倍，但两者之间差异无显著性意义（P>0.05）。

    2.4 细胞杀伤试验

    用MTT比色法测定抗原致敏DC诱导CIK（抗原?鄄DC?鄄CIK），空白的DC诱导CIK（空白?鄄DC?鄄CIK）及CIK对SGC细胞的杀伤活性（表1）。

    析因分析结果显示：①不同因素诱导CIK对胃癌细胞SGC杀伤作用不同，抗原致敏DC诱导CIK对该肿瘤细胞杀伤作用最强（P＜0.01），提示抗原致敏DC诱导CIK对该肿瘤细胞有特异性的杀伤作用。②不同效靶比之间杀伤作用不同（P＜0.01），结果比较显示效靶比越高，杀伤作用越强。③CIK与效靶比之间有交互作用，其中抗原致敏DC诱导CIK在效靶比为20：1时杀伤作用较其余各组强。但空白的DC诱导CIK与CIK 两组之间分析结果显示两组杀伤作用差异有无显著性意义（P>0.05），提示空白的DC诱导CIK对SGC无特异性杀伤作用。结合混合淋巴细胞反应结果提示，抗原致敏DC诱导CIK可通过激活对该肿瘤有特异性杀伤作用的淋巴细胞及促进淋巴细胞增殖两方面可显著性提高CIK对肿瘤的细胞杀伤作用。

    3 讨 论

    DC在体外的致敏与其在体内发育过程相似，经历未成熟与成熟两个阶段。未成熟DC来源于外周血或骨髓中的单个核细胞，经IL?鄄4及GM?鄄CSF诱导形成[3]。本研究亦用此方法获得DC。体外诱导DC成熟有抗原负载、细胞因子和佐剂刺激等方法。本研究从人胃癌细胞系SGC经超声破膜获取含有多种肿瘤抗原的肿瘤总蛋白，用其致敏DC，显微镜下可观察到致敏的DC细胞呈典型成熟DC的形态。用流式细胞仪检测DC表面分子结果显示 ,采用SGC抗原负载的DC，代表DC成熟的表面分子HLA?鄄DR、CD83、CD86升高，代表单个核细胞表面分子CD14下降，说明经SGC肿瘤细胞抗原负载可诱导DC成熟。

    肿瘤细胞总蛋白中包含有丰富的膜抗原、MHCⅠ类和Ⅱ类抗原表位、多种热休克蛋白分子等成分，经过DC的摄取、加工和呈递后，可激发针对多种肿瘤抗原簇的克隆[4]；可诱导针对该抗原的特异性细胞毒性T淋巴细胞，发挥有效的抗肿瘤免疫效应[5]。CIK细胞除了具有NK细胞非MHC限制的杀瘤作用，还具有T细胞的抗瘤作用。因此用抗原致敏的DC诱导CIK细胞，与未经抗原致敏的DC诱导CIK细胞及CIK细胞相比，对相同抗原靶细胞具有更强的杀伤作用。本研究中MTT试验的结果证实经抗原致敏的DC诱导CIK细胞的杀瘤作用较未经抗原致敏的DC诱导CIK细胞及CIK细胞杀瘤作用强。虞积仁等[6]也证实，抗原致敏的DC诱导ＣＩＫ细胞仅对带有相同抗原的靶细胞有特异性杀伤。而空白DC诱导CIK细胞与细胞因子诱导CIK缺乏特异性，两者之间杀伤试验无明显差异。张宏文等[7]研究亦发现同样结果。

    混合淋巴细胞反应结果显示DC与CIK混合培养72h后，视野中DC细胞消失与成熟DC在完成抗原呈递后凋亡有关[8]。空白的DC与抗原致敏的DC，两者均能明显促进CIK增殖，但两者之间差异无显著性意义，张嵩等[9]亦有类似的报道。说明成熟DC促进CIK增殖与有无抗原负载无关，可能与成熟DC高表达各种黏附分子与CIK表面的受体结合促进CIK细胞的增殖有关。

    本研究通过对人肿瘤细胞系SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK杀伤功能的试验研究，证实抗原致敏DC诱导CIK可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应，为进一步的临床试验研究提供试验依据。

【】
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