人参皂甙Rg3对荷瘤及环磷酰胺化疗小鼠黏膜免疫力影响
作者：吴皓 林洪生 裴迎霞 祁鑫 吕诚 赵林华 肖诚 吕爱平
【摘要】 ［目的］观察人参皂甙Rg3对肿瘤化疗肠道黏膜损伤的作用及其黏膜免疫机制。［方法］运用给小鼠原位接种C-26结肠癌并重复灌胃环磷酰胺建立肿瘤化疗肠道黏膜损伤的模型，观察人参皂甙Rg3对瘤重、抑瘤率及PP结面积影响，分离肠上皮内淋巴细胞，固有层淋巴细胞及PP结内的淋巴细胞，用免疫荧光染色及流式细胞仪分析黏膜免疫各部位T淋巴细胞亚群的变化。［结果］环磷酰胺组瘤重显著降低，抑瘤率约为37.6%，而环磷酰胺加Rg3组瘤重与环磷酰胺组比较差异无显著性。荷瘤及环磷酰胺都可显著降低PP结面积，而人参皂甙Rg3可明显减轻环磷酰胺对PP结面积的影响(P<0.01)。人参皂甙Rg3可使荷瘤和环磷酰胺作用下显著减少的固有层淋巴细胞中的CD4+细胞百分比显著增加(P<0.05)，但对CD8+细胞百分比无明显影响。［结论］荷瘤及环磷酰胺可明显抑制肠道黏膜免疫功能，而人参皂甙Rg3能明显改善这种黏膜免疫抑制状态。人参皂甙Rg3对黏膜免疫的调节作用是扶正中药发挥作用的重要途径之一。
【关键词】 人参皂甙Rg3 黏膜免疫 肿瘤 环磷酰胺 小鼠
黏膜损伤（mucosal injure, MI）是肿瘤化疗中常见的毒副反应 [1]。临床上黏膜损伤不但会引起疼痛，严重地影响患者的生活质量并降低治疗效果，而且是患者并发感染的重要危险因素。权威机构发表的报告认为黏膜炎不仅是放化疗作用于上皮干细胞引起的局限于黏膜上皮的毒性反应，更是黏膜下的其它细胞和细胞外基质都参加的一个复杂的过程[2]。临床研究表明，扶正中药对化疗引起的胃肠道毒副作用及黏膜炎有良好的治疗作用[3，4]。《灵枢·五癃津液别》云：“脾为之卫”。祖国医学认为脾胃功能旺盛是保证机体健康、抵抗外邪侵犯的重要因素。医学也发现成人黏膜有重要屏障功能，是一个强大的免疫系统。目前有关化疗对小肠黏膜免疫系统的影响及中药扶正药治疗荷瘤机体化疗所致黏膜炎的黏膜免疫机制还未见有全面报道。本研究以环磷酰胺多次灌胃的荷瘤小鼠为模型，研究人参皂甙Rg3治疗化疗所致的黏膜损伤的黏膜免疫机制。
1 材料与方法
1.1 材 料
雌性BALB/c小鼠，3周龄，60只，由医学院实验动物研究中心提供，清洁级，体重（16±2）g，许可证号：SCXK（京）2000?鄄0006。随机分为4组:Ⅰ.假手术组，15只；Ⅱ. 荷瘤模型组，15只；Ⅲ.环磷酰胺组，15只；Ⅳ.环磷酰胺加Rg3组，15只。C?鄄26结肠癌瘤株：中国医学科学院药物所韩锐研究员惠赠。FITC标记的抗小鼠CD3e，PE标记的抗小鼠CD4，PE?鄄cy5标记的抗小鼠CD8，eBioscience公司产品（购自晶美公司）。
1.2 方 法
肿瘤细胞接种: 选取生长良好的C?鄄26结肠癌瘤组织，按肿瘤（g）：生理盐水（ml）为1：3比例匀浆，调整细胞数为5×107/ml。荷瘤模型组、环磷酰胺组及环磷酰胺加Rg3组，在麻醉状态下打开腹腔，将20μl C?鄄26肿瘤细胞（共1×106）接种于盲肠浆膜下，缝合腹壁，造成荷瘤C?鄄26结肠癌模型。假手术组：同样条件下开腹，盲肠浆膜下注射20ml生理盐水。
灌胃及施灸方法：假手术组，从接种后至处死为止，每日0.9%生理盐水200μl灌胃。环磷酰胺组从接种后第1~12d，给予0.9%生理盐水200μl灌胃，第13~17d，每日给予环磷酰胺200ml（总剂量为5μg）灌胃。环磷酰胺加Rg3组从手术后第2d起到17d止,每日给予人参皂甙Rg3 200μl(每日200mg/kg)灌胃，第13~17d，每日给予环磷酰胺200μl（总剂量为5μg）灌胃。
1.3 检测指标及方法
瘤重及抑瘤率的：打开腹腔，剥离肿瘤，称重，并计算环磷酰胺的抑瘤率。
抑瘤率=（实验组的平均瘤重/对照组的平均瘤重）×100%
记录PP结面积：取出全部小肠。用含5%NCS的D?鄄Hank’s液冲洗肠腔。肉眼观察PP结，记录个数和面积，并剪下PP结。
小肠黏膜淋巴细胞的分离：用细塑料绳穿过肠腔，翻转小肠使黏膜面向外。翻转后的小肠置于37℃预热消化液中。放入恒温箱中于37℃孵育40min，取出离心管充分振荡，用300目的尼龙网滤过消化液。消化液过滤后离心1min（1 000r/min），去除上清，加入含5%NCS的1640培养液及100%percoll，充分混匀后成为40%细胞?鄄percoll混悬液，用巴式毛细吸管在试管底部轻轻加入 1ml 70%percoll，使两层液体间形成清晰的界面，制成percoll梯度分离液。离心600g，25℃，20min。收到40%与70%percoll界面间的细胞，用含5%NCS的D?鄄Hank’s液洗3次，即为IEL。去除IEL后, 将经过消化液消化振荡后的小肠移入含有0.1%Ⅱ型胶原酶的1640培养液10ml的预热离心管中。放入恒温箱中，于37℃孵育40min。取出离心管充分振荡，用300目的尼龙网过滤。滤液离心1min（1 000r/min），去除上清，加入含5%NCS的1640培养液，调整体积至5.4ml，再加入100%percoll至9ml，充分混匀后成为40%细胞?鄄percoll混悬液，用巴式毛细吸管在试管底部轻轻加入 1ml 70%percoll，使两层液体间形成清晰的界面，制成percoll梯度分离液。离心600g，25℃，20min。收到40%与70%percoll界面间的细胞，用含5%NCS的D?鄄Hank’s培养液洗3次，即为LPL。
分别用FITC、PE、PE?鄄cy5标记的抗小鼠CD4、CD8、CD3单抗对分离的淋巴细胞进行免疫荧光染色（用量参照产品说明书）。用D?鄄Hank’s将所分离的小肠黏膜淋巴细胞浓度调整为5×106个/ml，按106/μl细胞量加入荧光抗体, 室温下避光40min，之后用生理盐水洗1遍，上流式细胞仪进行检测。收集4 000个细胞用于数据分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS统计软件，独立样本t检验进行数据分析。
2 结 果
2.1 各组瘤重和抑瘤率
环磷酰胺组及环磷酰胺加Rg3组瘤重与模型组比较明显减低（P值均小于0.01），表明环磷酰胺对肿瘤有明显的抑制作用。环磷酰胺加Rg3组与环磷酰胺组相比，瘤重变化差异无显著性（P=0.998），表明人参皂甙Rg3对化疗后的瘤重无影响，即人参皂甙Rg3对肿瘤瘤体无促进作用。参见表1。
2.2 各组小鼠PP结面积
环磷酰胺加Rg3组小鼠肠道PP结面积与环磷酰胺组比较明显增加，两组差异有显著性（P=0.004），表明Rg3可改善荷瘤和环磷酰胺共同作用造成的黏膜局部免疫功能严重抑制（见表2）。
2.3 各组小鼠LPL中CD4+细胞百分比
由表3对荷瘤和化疗模型的研究显示，假手术组LPL中CD4+细胞百分比明显高于荷瘤模型组和环磷酰胺组，与后两者相比有显著性差异（分别为P=0.04和P<0.001），环磷酰胺组CD4+的淋巴细胞也明显低于荷瘤模型组 (P<0.001)。人参皂甙Rg3能显著增加LPL中的CD4+细胞，环磷酰胺加Rg3组与环磷酰胺组相比差异有显著性（P=0.031）。且环磷酰胺加Rg3组中LPL CD4+细胞百分比与荷瘤模型组比较差异无显著性（P=0.183），说明Rg3可使环磷酰胺作用下显著减少的LPL CD4+细胞基本恢复到未使用环磷酰胺的水平。
2.4 LPL中CD8+细胞百分比
LPL中CD8+的淋巴细胞百分比，环磷酰胺组及荷瘤模型组与假手术组比较显著增高(P值均<0.05)，见表4。环磷酰胺组与荷瘤模型组比较无显著性差异（P=0.809），可见荷瘤和环磷酰胺可增高LPL中CD8+的淋巴细胞百分比。而环磷酰胺加Rg3组与环磷酰胺组比较均无显著性差异，可见人参皂甙Rg3对LPL中CD8+的淋巴细胞百分比无显著性作用。
3 讨 论
对人参及其各种有效成分的抗肿瘤作用和机制，已有大量的相关报道[3，4]。人参皂甙Rg3是从人参中提取的四环三萜类人参二型皂甙单体，能显著提高荷瘤小鼠免疫功能[5，6]，并对肿瘤的化疗有减毒增效作用[7，8]。
医学发现成人黏膜面积为400m2，不仅有物理和化学的防护功能，同时也是一个复杂的免疫系统。黏膜免疫系统由包括肠道、鼻、眼、泌尿生殖道和直肠黏膜及某些外分泌腺（如唾液腺、乳腺等）黏膜相关的淋巴组织共同构成的一个免疫体系。黏膜部位是机体免疫系统的第一道防线，而黏膜免疫系统也是机体中最大的免疫器官之一。PP结是抗原进入肠组织并与免疫系统接触产生初级免疫反应的部位，是黏膜免疫中主要的诱导部位。肠固有层淋巴细胞（iLPL）是黏膜免疫效应部位中主要细胞成分之一,是一群功能特殊的细胞。LPL中的T细胞是一群曾经被激活的记忆T细胞，其高度活化状态表现为：①大部分细胞都表达IL?鄄2mRNA及IL?鄄2Rα链。②自发表达IL?鄄2，IL?鄄4，IL?鄄5，IFN?鄄γ的mRNA，且产生IL?鄄5及IFN?鄄γ的数量要比同样条件下脾细胞产生的多2~3倍[9]。③在适当的刺激下可分泌多种细胞因子，Th1类（如IFN?鄄γ）、Th2类（如IL?鄄4、IL?鄄5）都有分泌。④因LPL可自发分泌IL?鄄2及IFN?鄄γ，对B细胞合成抗体有辅助作用[4]。LPL的高度活化状态可能是它们持续暴露于肠腔抗原的结果[9]。
本实验以环磷酰胺多次灌胃的荷瘤小鼠为模型，研究了肿瘤及化疗时黏膜免疫的变化及人参皂甙Rg3黏膜损伤的黏膜免疫机制。首先，我们观察了各组小鼠的瘤重并了荷瘤模型组，环磷酰胺组及环磷酰胺加灸组的抑瘤率，结果人参皂甙Rg3对肿瘤瘤体无促进作用。对于各组小鼠肠道PP结面积的比较显示，荷瘤小鼠受肿瘤影响，肠道PP结的面积明显减少，环磷酰胺进一步抑制了荷瘤小鼠本已受损的黏膜免疫功能。这与周氏[10]报道的环磷酰胺可诱导PP结数目减少的情况相一致。本实验结果显示环磷酰胺还可引起固有层中CD4+T淋巴细胞显著降低，可见环磷酰胺可导致肠黏膜免疫功能障碍，这种功能障碍可能也在化疗所致的黏膜损伤中扮演了重要角色。而人参皂甙Rg3可在荷瘤和化疗时增加PP结的总面积，还能明显提高LPL中因荷瘤及环磷酰胺化疗导致的CD4+细胞百分比减低，改善荷瘤和环磷酰胺共同作用造成的黏膜局部免疫功能严重抑制。这可能是其调节免疫，治疗肿瘤的机制之一。
【】
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