人腺样囊性癌多药耐药细胞系的建立
【摘要】 目的：建立人腺样囊性癌耐药细胞系，为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转耐药提供模型及研究依据。
方法：以长春新碱（VCR）为诱导剂，通过浓度递增间断刺激法对人腺样囊性癌细胞系（ACC）进行体外诱导耐药，建立耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR。细胞计数法绘制细胞生长曲线，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞对化疗药物敏感性。 结果：ACC经体外诱导后，ACC/VCR细胞对长春新碱（VCR）、阿霉素（ADM）和平阳霉素（PYM）的耐药性明显增强，具有交叉耐药，对环磷酰胺（CTX）、氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）耐药性无明显变化。耐药前后ACC细胞的生长曲线、群体倍增时间和光镜下的形态无明显改变。结论：VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药。
【关键词】 腺样囊性癌 多药耐药 长春新碱
Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma
Abstract AIM: To establish an in vitro resistance model of adenoid cystic carcinoma which can provide theoretical information for elucidating the mechanisms of multidrug resistance (MDR), improving the chemotherapy scheme, evaluating the prognosis and reserving the MDR in adenoid cystic carcinoma.METHODS: The resistance cell line, ACC/VCR, was induced in the ACC cell line in vitro by progressive concentrations of vincristine (VCR), a drug of choice in the treatment of adenoid cystic carcinoma. The growth curve, drug sensitivity in the parental and resistant cell lines were investigated by cell counting and MTT assay. RESULTS: ACC/VCR cell line was cross-resistant to vincristine (VCR), adriamycine (ADM) and pingyangmycin (PYM), but not resistant to Cyclophosphamide (CTX), fluorouracil (5-FU) and cisplatin (DDP). There was no significant difference in the doubling time and morphological changes between ACC cell line and ACC/VCR cell line. CONCLUSION: Exposing to VCR can induce MDR in adenoid cystic carcinoma.
· KEYWORDS: adenoid cystic carcinoma; multidrug resistance; vincristine
Zhou XD, Song GX, Sui ZF, Chang JW. Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2007;7(2):417-419
0引言
腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma,ACC）是一种高度恶性的上皮性肿瘤，可发生于全身各部位，如涎腺、颌下腺、气管、肺、乳腺、皮肤等，于眼眶则好发于泪腺[1]。目前对腺样囊性癌的以综合治疗为主，其中化疗主要作为新辅助化疗（术前或放疗前化疗）、辅助化疗（手术后或放疗后化疗）、放疗增敏剂和姑息性化疗应用[2]。有的肿瘤细胞在对一种化疗药物耐药的同时,对其他结构和机制不同的化疗药物也产生耐药性，称为肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR) [3]。多药耐药的产生是导致肿瘤产生耐药和化疗失败的重要原因之一。我们通过长春新碱诱导建立腺样囊性癌耐药细胞系，旨在为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制，指导多药耐药逆转剂的研究提供模型和研究依据。
1材料和方法
1.1材料 人腺样囊性癌(ACC)细胞系购自上海申能博彩公司。RPMI1640干粉培养基(Gibco公司),胎牛血清(天津灏阳生物有限公司，56℃40min灭活补体),青、链霉素(石家庄制药厂),谷氨酰胺（L-glutamina）(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司),依地酸二钠（EDTA）(广州化学试剂厂),二甲基亚砜（DMSO）(北京鼎国生物有限公司),噻唑蓝（MTT）(北京鼎国生物有限公司),长春新碱（vincristine,VCR）(上海华联制药有限公司),环磷酰胺(CTX)(上海华联制药有限公司),阿霉素(adriamycin,ADM)(深圳万乐药业有限公司),氟尿嘧啶(5-FU)(天津市氨基酸公司人民制药厂),平阳霉素(PYM)(天津太河制药有限公司)，顺铂(DDP)(山东齐鲁制药厂)。CO2培养箱（Heraeus，德国），倒置显微镜（Olympus-1M，日本），生物显微镜 （Olympus BH-2，日本），紫外分光光度计（UV754，上海分析仪器厂），台式高速离心机（Allegra64R，美国Beckman），磁力搅拌器（江苏省金坛市通济仪器厂），酶联仪（DG-3022A，南京管厂）。
1.2方法 ACC细胞系培养在含100ml/L灭活胎牛血清、100kU/L青、链霉素的RPMI1640培养液中。培养条件：37℃，50ml/L CO2，每3d换液1次，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化传代，约5d传代1次。采用VCR浓度递增间断刺激法选择耐药细胞，具体步骤如下：VCR 15μg/L×7d，去药7d，VCR 30μg/L×7d，去药7d，VCR 60μg/L×7d，去药7d，VCR 60μg/L×7d，去药7d，VCR 120μg/L×7d，去药7d，VCR 120μg/L×7d，去药7d，VCR 250μg/L×7d，去药7d，VCR 250μg/L×7d，去药7d，无药培养7d后进行实验。取生长状态良好的细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化制成细胞悬液，计数，将细胞悬液接种于24孔板，每孔1mL，接种浓度1×107/L，37℃，50ml/L CO2培养。每日取3孔板细胞进行计数，均值。连续观察7d，其间培养3d后给未计数的细胞换液。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），在半对数坐标纸上绘制生长曲线，根据公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。TD(倍增时间) = t（培养时间h）×lg2/（lgNt-lgN0）。N0，Nt：接种后及培养t h后的细胞数。MTT比色实验[4]测定化疗药物敏感性：取对数生长期细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/LEDTA消化，用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液配成5×106～1×107/L的单个细胞悬液；取96孔培养板，每孔加入200μL细胞悬液，37℃，50 ml/L CO2培养过夜；更换培养液，并按一系列浓度（终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100、1 000 mg/L）加入抗肿瘤药物，每浓度重复3孔，以不加细胞只加培养液的孔作为空白对照，37℃，50 ml/L CO2培养72h；每孔加5g/L MTT溶液20μL，37℃，50 ml/L CO2继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10min，使其充分溶解；选择490nm波长，在酶联仪上测定各孔吸光度（A ）；按公式计算细胞存活率，以细胞存活率对药物浓度对数作图，求出药物半数抑制浓度（IC50），计算耐药系数（resistance factor,RF）。细胞存活率（%）=试验组吸光值A /对照组吸光值A×100%，RF=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。
2结果
2.1细胞系的建立 ACC细胞系经VCR体外诱导筛选，连续培养4mo，获得了在250μg/L VCR作用下生长良好的耐药细胞系。命名为ACC/VCR。无药培养2mo，对VCR的耐药指数无明显下降，说明已有稳定的耐药性。VCR在体外诱导耐药的培养过程中，加药后细胞出现肿胀，胞浆内颗粒较粗，细胞生长受抑，增殖速度很慢甚至不增殖，随之大量脱壁、数目减少。换用不含VCR的培养液培养，并适当延长传代周期，存活下来的耐药细胞生长分裂加快，形成多个细胞克隆，再逐渐融合成片，但细胞大小不一，排列紊乱，异型性较为明显。然后继续用含VCR的培养液筛选。经过几次筛选后，不耐药或耐药性低的的细胞被排除，余下的是有较高抗药性的细胞。
2.2细胞形态学观察 ACC和ACC/VCR细胞在体外均为贴壁生长，在倒置显微镜下为多角形上皮样细胞，大小较为一致，胞质内可见透亮度深浅不等的颗粒，核大，类圆形或不规则形，核/质比例高，核仁2～3个，清晰可见的，并可见巨大融合细胞。细胞分裂相多见，并有多级核分裂，排列紧密时细胞互相镶嵌成铺路石样，密度再增高时可重叠生长，表现为接触抑制消失（图1A，B）。ACC和ACC/VCR细胞在体外增殖速度相似（生长曲线见图2）。群体倍增时间分别为28.32±1.65h和27.55±0.89h，两组间比较无显著性差异（t =1.162，P =0.311）。
2.3耐药谱 ACC/VCR不仅对原诱导药物VCR具有耐药性，而且对ADM，PYM有交叉耐药性（表1）。各种化疗药物临床常用量所达血药浓度分别为：VCR 0.25mg/L；CTX 140mg/L；ADM 6mg/L；5-FU 50mg/L；PYM 20mg/L；DDP 5mg/L。
3讨论
近年的研究发现,肿瘤细胞一般多对天然植物碱及其人工半合成衍生物类(如长春新碱、长春花碱、秋水仙碱等、鬼臼乙叉甙等)和抗生素类(如阿霉素、放线菌素Ｄ、柔红霉素、光神霉素等)药物易产生耐药和交叉耐药,而且不同组织来源的肿瘤其发生多药耐药的机制亦各不相同[5]。对MDR的研究对于改善肿瘤患者预后，制定合理的治疗方案以防止MDR出现或逆转MDR有重要意义。体外建立耐药细胞系国内外均见报道，常用的方法是浓度递增间断刺激法[6，7]，即通过在体外培养的亲代细胞中逐渐增加某一种化疗药物的浓度，通过药物选择作用获得耐药细胞系，为体外研究多药耐药提供模型。当然，药物在体内的代谢和作用过程远比体外复杂，不应单纯进行体外实验而忽视对临床标本的研究。
有关人ACC细胞体外实验的研究目前国内外多有报道，现已建立有SACC83，ACC-M等细胞系，并进行了一系列有关药物敏感性测试、放射、生物治疗等方面的实验研究[8，9]。但是，体外环境远不如体内复杂，而且在体外培养过程中，肿瘤细胞的某些生物学特性可能会发生变化，与实际的过程可能有一定出入，因此体外实验得出的结论有时并不能完全解释肿瘤在机体内的生物学行为和病理过程。作为肿瘤细胞，ACC为无限细胞系，在体外可无限传代生长，但培养过程中失去了原有的腺管样排列结构，铺成片状，接近于实性型的细胞排列结构。我们以长春新碱为诱导剂，通过浓度递增间断刺激法在体外对ACC细胞系进行筛选和诱导耐药，建立了耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR。VCR是目前ACC化疗中最常使用的药物之一，也是化疗药物中最易产生耐药的一种。目前国内外多有建立肿瘤耐药模型的报道，VCR是最常使用的药物之一，浓度递增间断刺激法是最常见的诱导方法，它与临床上化疗药物的使用具有一定相似之处[6]。通过在体外建立耐药模型，可对肿瘤多药耐药机制进行研究，用于解释肿瘤在体内发生耐药的机制，还可以为耐药逆转剂的研究提供基础。 ACC和ACC/VCR细胞在生长曲线及群体倍增时间上无明显变化，在倒置显微镜下，细胞形态学亦无明显变化。但有研究表明，在电镜下亲代细胞和耐药细胞存在形态学变化。Prados等[10]在研究以放线菌素D（DAC）为诱导剂建立的横纹肌肉瘤耐药细胞系时发现，电镜下耐药细胞出现胞质内肌丝成分聚集、细胞器增多、双叶核等改变，细胞形态学的变化主要体现在超微结构上。
恶性肿瘤的药物敏感性研究一直是肿瘤治疗学研究中的热门问题，准确快速的肿瘤化疗药敏检测对指导临床选择化疗药，提高疗效具有重要意义[11,12]。但目前主要集中在实验室研究，真正进入临床前瞻性研究，指导临床治疗的还很少，尤其是在国内，尚未见进行临床试验的报道。目前对于ACC化疗效果的临床研究看法不一，对于化疗方案的选择差异很大。这可能与肿瘤的生物学特性（组织学分型、分化程度和细胞动力学等）、患者的个体差异（对化疗药物的敏感度和耐受程度）、药物本身的毒性反应等有关。在临床上常常使用同一种化疗方案治疗同一种肿瘤的不同患者甚至是患有不同肿瘤的患者，这显然是不的，针对不同患者进行肿瘤药物敏感试验以选择有效的化疗药物，制定个体化的化疗方案，才是今后化疗的趋势。我们选取的6种化疗药物，作用机制各不相同，且均是目前临床上比较常用的用于治疗ACC的化疗药物[13]。自1983年Mosmann首先利用MTT研究瘤细胞生存状况以来,MTT法药敏试验迅速建立并得到发展[4]。其染色剂是一种能接受氢原子的染料，化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑嗅盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazo－diumbromide，MTT)，商品名噻唑蓝，简称为MTT。MTT法的特点是灵敏度高、快速、简便、,不需放射性同位素,结果重复性好,并可同时对多种药物进行筛选和观察，可适用于所有肿瘤类型，目前美国国立癌症研究所已将其作为筛选化疗药物的常规手段。我们采用MTT法进行体外药物敏感性试验，结果显示，由亲代细胞诱导得来的耐药细胞ACC/VCR不仅对VCR耐药，而且对ADM，PYM发生了交叉耐药。这与目前研究认为多药耐药多见于天然来源的化疗药物的观点相符。通过MTT试验我们发现，化疗药物常规临床用量所达到的血药浓度多数对肿瘤细胞增殖达不到有效的抑制作用，然而通过无限制增加药物用量以达到杀灭肿瘤细胞目的的做法只可用于体外实验，在临床上盲目增大化疗药用量会大大增加对人体的毒副作用，甚至可能带来致命的后果。解决的办法有两个,一是通过逆转耐药剂的研制,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,以减少用药量，减轻毒副作用；二是研发全新的药物剂型，使药物具有靶向性和缓释性的特点，肿瘤组织局部可以达到有效血药浓度而外周血药物浓度很低。例如，研制全新的多药耐药逆转剂，针对已知多药耐药相关基因进行基因治疗逆转耐药[14]，以及用具有缓释作用的纳米粒子包裹化疗药物进行主动靶向治疗的研究[15]，都会是今后化疗研究的新热点。
【】
1宋国祥,吴中耀.眼眶病学.第1版.北京:人民卫生出版社,1999:235-239
2韩锐,主编.肿瘤化学预防及药物治疗.第1版.北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1991:418-420
3 Lehnert M. Clinical multidrug resistance in cancer: a multifactorial problem. Europ J Cancer ,1996;32:912-920
4韩晓凤.MTT法体外药敏试验研究进展.肿瘤,1999;19:55-59
5 Stavrovskaya AA. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells. Biochemistry ,2000;65:95-106
6 Chaudhary PM,Roninson IB.Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs. National Cancer Institute ,1993;85:632-639
7徐和平,王成业,祝和成,牛喜林,顾焕华,刘双珍,徐雪亮.耐长春新碱视网膜母细胞瘤株的建立.中华眼底病杂志,1997;13:6-9
8刘臣恒.人涎腺腺样囊性癌(SACC-83)细胞系的建立及其生物学特性.中华口腔医学杂志,1990;25:29-31
9关晓峰,邱蔚六,何荣根,林国础,周晓健.肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选.中华口腔医学杂志,1996;31:74-76
10 Prados J,Melguizo C,Marchal JA,Velez C,Alvarez L,Aranega A.Therapeutic diffeentiation in a human rhabdomyosarcoma cell line selected for resistance to actinomycin D. Int J Cancer ,1998;75:379-383
11毛立民,于世凤,孙开华,刘红岩,徐少锋,韩锐.涎腺腺样囊性癌细胞对抗癌药物敏感性的研究.口腔医学杂志,2000;14:19-21
12张虹,韩嫒嫒,周晓冬,何彦津,宋国祥.眼眶腺样囊性癌动物模型的建立及局部化学治疗的初步观察.国际眼科杂志,2006;6(5):1049-1052
13李雅冬.口腔颌面部恶性肿瘤化疗药物现状.天津药学,2002;14:22-23
14李秀荣,吕翠霞,宋茂美,焦中华.肿瘤的多药耐药及耐药逆转剂研究.肿瘤防治杂志,2000;7:73-76
15赵硕,常津.载药纳米微粒制备技术.化学通报,2002;65:93-96
