喉癌组织中核转录因子NF?kB的定量检测

【摘要】  探讨核转录因子(nuclear transcription factor kappa B, NF?kB)的定量检测在喉癌组织中的意义。 方法：采用蛋白质印迹杂交法（Western blot法）和凝胶电泳迁移率（EMSA）法对20例喉癌组织和10例癌旁正常组织中NF?kB的蛋白含量以及NF?kB DNA结合活性进行定量检测，并进行分析比较。 结果：喉癌组织中NF?kB的蛋白含量以及NF?kB DNA结合活性均明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：NF?kB在喉癌的发生过程中可能起一定的作用，并为喉癌的能提供一个新靶点。

【关键词】  喉肿瘤 核转录因子 蛋白质印迹杂交 凝胶电泳迁移率

      A A quantitative analysis of NF?kB   in laryngeal carcinoma

     ［ABSTRACT］  Objective:  To explore the significance of the quantitative analysis of NF?kB in laryngeal carcinoma tissues. Methods:  The quantitative analysis of the protein content and the  DNA binding activity of NF?kB was examined by the Western blot method and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method in 20 cases of laryngeal carcinoma tissues and 10 cases of normal pericarcinoma tissues. Results:   The protein content and  the DNA binding activity of NF?kB in laryngeal carcinoma tissues were higher than those in pericarcinoma normal tissues（P<0.05）. Conclusion:  The NF?kB might play an important role in the occurrence and development of laryngeal carcinoma and offers a new target of laryngeal carcinoma treatment.

    ［KEY WORDS］  Laryngeal neoplasms; Nuclear transcription factor kappa B;  Western blot;  Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)    核转录因子（NF?kB）广泛存在于真核细胞中，通过调控众多下游基因的转录来参与机体的免疫应答、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤形成过程。近年有很多研究报道NF?kB在大肠癌、宫颈癌、肺癌、肝癌等组织中有较强的表达，而在喉癌组织中较少，且仅为免疫组化的定性分析。我们应用蛋白质印迹杂交法（Western blot法）和凝胶电泳迁移率（EMSA）法定量检测了20例喉癌组织中NF?kB的表达情况，现报道如下。

    1  资料与方法

    1.1  材料来源  20例喉癌组织标本均从2002年7月至2003年12月重庆医科大学附属第一第一 次住院的喉癌患者中获得，无放化疗史，均为非转移性；术前及术后病理检查证实均为喉鳞状细胞癌；所有标本手术切除后3?min内采集，同时术中切取10例癌旁组织作为喉正常组织作对照（实验前病理证实为正常组织），采集后将标本置于-70?℃液氮保存备用。

    1.2  试剂  NF?kB P65抗体（一抗）和Western blot luminol reagent 购自美国satus cruzs公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（二抗）购自北京中山公司;T4多核苷酸激酶和NF?kB探针（5′?AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC?3′, 3′?TCAACTCCCCTGAAAGGGT?CCG?5′）购自美国Promega公司;［r?32p］ATP购自北京亚辉公司。

    1.3  方法 

    1．3．1  蛋白质印迹杂交法（Western  blot法）  精确称取备用的喉癌和正常组织0.1?g经匀浆离心后取上清液，考马斯亮蓝G?250测核蛋白浓度，并调整核蛋白浓度为5?μg/μl, 置于-70?℃保存备用。每泳道取20?μl提取核蛋白，用十二烷基硫酸钠(SDS)?聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，电转至固相支持体硝酸纤维素滤膜上，分别按程序加入NF?kBP65一抗和二抗，发光试剂发光，照像。应用分析软件对Western杂交蛋白区带进行积分光密度值测定。

    1．3．2  凝胶电泳迁移率（EMSA）法  将上述提取的上清液，考马斯亮蓝G?250测核蛋白浓度，并调整核蛋白浓度为1?μg/μl, 置于-70?℃保存备用。用T4多核苷酸激酶和［r?32p］ATP对寡核苷酸NF?kB探针进行末端标记，与提取的核蛋白进行结合反应。反应液经7%非解离聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后放射自显影。用分析软件以积分光密度值表示电泳区带的结果。

    1.4  统计学处理  所有数据均用±s表示，采用t检验，以P<0.05为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  Western blot法检测NF?kBP65蛋白  喉癌组织中NF?kB蛋白区带加宽，深于正常对照组织（图1），其NF?kB蛋白积分光密度值为1?775.87±362.81, 癌旁正常组织NF?kB蛋白积分光密度值为476.42±53.00，二者比较有统计学意义（t=15.69，t0.05=2.1，P<0.05），即喉癌组织中NF?kB的蛋白含量明显高于癌旁正常组织。

    2.2  EMSA法检测NF?kB DNA结合活性  喉癌组织中有较强的DNA结合活性的NF?kB条带（图2），其积分光密度值为10?962.91±2?938.44，而癌旁正常组织NF?kB DNA结合活性积分光密度值为1?426.88±70.80，二者比较有统计学意义（t=14.5，t0.05=2.1，P<0.05），即喉癌组织中NF?kB DNA结合活性明显高于癌旁正常组织。

    3  讨  论

    核转录因子NF?kB是1986年Sen 和Baltimore首先从成熟B淋巴细胞中发现的［1］，其命名是由于该细胞核的提取物中检测到了一种能与免疫球蛋白k轻链基因增强子kB序列（GCGACTTTC）特异结合的核蛋白因子。它是由Rel蛋白家族中成员以同源或异源二聚体的形式组成的蛋白质，其主要存在形式为P50和P65组成的二聚体［2，3］。NF?kB属DNA结合蛋白，具有结合某些基因启动子kB序列并启动靶基因转录的功能。静息状态下，NF?kB二聚体在胞浆内没有活性，在细胞外信号（如白细胞介素?1、肿瘤坏死因子、蛋白合成抑制剂、紫外线等）的诱导刺激下，在NF?kB转录通路的上游激酶的级联作用下，NF?kB核定位信号暴露，致使NF?kB被激活并异位进入细胞核内与靶基因的kB位点结合，启动下游基因的转录和表达。现在的研究表明，NF?kB是细胞分裂和生存的关键调节因子，同时亦是细胞凋亡的一个重要调控因子，它在疾病的发生过程中具有双重作用，诱导NF?kB活性的改变来疾病已成为目前的研究热点。

    NF?kB与肿瘤的形成与发展密切相关，研究表明NF?kB与肿瘤的关系表现为：（1）癌基因通过NF?kB介导途径而致癌；（2）NF?kB通过抑制凋亡途径而致癌；（3）NF?kB涉及多种生长因子的转录调节，而这些生长因子与肿瘤的细胞生长密切相关。

    Nakayama等［4］采用免疫组化研究了36例口腔鳞癌，发现NF?kBP65在几乎所有的癌组织中均有较强的阳性表达，而癌旁组织和口腔黏膜白斑中无表达。Christian等［5］利用免疫组化和Western blot法发现人大肠癌组织细胞中NF?kBP65不仅在癌细胞中异常表达而且在细胞核中过度表达，而正常大肠组织细胞中未见表达。Evertsson等［6］研究了138例大肠癌，用免疫组化法发现63%的患者其NF?kBP65在细胞质中表达，而37%在细胞核中表达，且NF?kBP65的表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、Duke′s分期、凋亡指数、bcl?2表达无明显关系，但发现它在黏液癌中的表达比一般的癌组织高，而且在肿瘤的侵袭边缘有更高的表达。NF?kB在喉癌组织中的研究报道较少，朱江等［7］采用免疫组化法研究发现，NF?kBP65的活性表达在喉癌组织中明显高于癌旁正常组织，并且差异有统计学意义。上述研究均表明，NF?kB在恶性肿瘤组织中是存在的，并且有较高的活性水平。

    本实验通过Western  blot和EMSA两种方法对喉癌组织中NF?kBP65进行了定量检测，避免了免疫组化这种定性方法人为因素的干扰，且准确性相对较高，两种实验均发现喉癌组织中NF?kBP65的蛋白含量以及NF?kB DNA结合活性均明显高于癌旁正常组织，并且有统计学意义。这和朱江等采用免疫组化的方法对喉癌的研究结论是一致的，这提示我们NF?kBP65的高活性在喉癌组织中是存在的，并且可能与喉癌的发生是有密切关系的一种癌蛋白，在喉癌的发生发展过程中可能起着一定的调节作用。由于我们所研究样本例数较少，NF?kB在喉癌中的表达及作用还有待于进一步探讨。

    NF?kB是细胞分化与细胞凋亡等信号通路的交汇点，抑制NF?kB的过度表达，可以阻断其靶基因产物的产生，因此，对NF?kB基因进行药物抑制或干预，从而抑制肿瘤的生长，这将为喉癌的治疗提供一个新的方法。

【】
  ［1］ 〖ZK(#]Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences［J］. Cell, 1986, 46(5):705?716.

［2］ Baldwin As Jr. The NF?kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights［J］. Annu Rev Immunol, 1996, 14（7）:649?683.

［3］ Chen F, Castranova V, Shi X, et al. New insights into the role of nuclear factors?KB, a ubiquitous transcription factor in the initiation of the diseases［J］. Clinical Chemistry, 1999, 45(1):7?17.

［4］ Nakayama H, Ikebe T, Beppll M, et al. High expression levels of nuclear factor Kappa B,I kappa B Kinase alpha and Akt kinase in squamous cell carcinoma of the oral cavity［J］. Cancer, 2001, 92(31):3037?3044.

［5］ Christian M, Michalis PC, Upinder B, et al. Expression of cyclooxygenase?2 parallels expression of interleukin?1 beta,interleukin?6 and NF?KB in human colorectal cancer［J］. Carcimogenesis, 2003, 24(4):665.

［6］ Evertsson S, Sun XF. Protein expression of NF?KB in human colorectal adenocarcinoma［J］. Int Mol Med, 2002, 10(5):547.

［7］ 朱江,胡国华,孙余才. 喉癌组织中NF?KB和IKB的表达及其意义［J］. 实用癌症杂志,2004,19(2):136?138.