当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后p53蛋白表达的影响

【摘要】  目的:观察当归对缺血再灌注损伤心肌细胞内p53蛋白表达的影响，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组（ n=10）:正常对照组（n=5）;假手术组（n=10）;缺血再灌注组（n=10）;当归组（n =10） ，建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内p53蛋白表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定p53蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果:正常对照组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性;当归治疗组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性。假手术组心肌细胞内p53蛋白表达呈阴性，缺血再灌注损伤组p53蛋白表达呈阳性。图像分析结果显示:正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间p53蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（ P <0.01）;正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义（ P >0 05）。结论:当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。

【关键词】  当归注射液; 缺血再灌注; 心肌; p53蛋白

　　目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种药物能绝对减少心肌梗死，对抗心肌缺血。当归是活血养血的传统中药，具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用，临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病。p53基因为一抑癌基因，分野生型（wt-p53）和突变型（mt-p53）。野生型p53基因可以抑制肿瘤的生长，而突变型的p53基因，可以通过多种途径促进肿瘤的生长、浸润，并对预后有明显的影响。近年来人们发现p53基因与细胞凋亡有密切关系。正常的p53基因即野生型p53基因（wt-p53）与突变型p53基因（mt-p53）均参与细胞凋亡的调节。野生型p53基因能诱导白细胞的凋亡，突变型p53基因则抑制细胞凋亡。 当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis（Oliv.）Diels的干燥根。味甘、辛，性温，能补血和血，调经止痛，润燥滑肠。有报道［1］，当归对冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性ST-T 的变化， 是治疗冠心病的有效药物［2］。本实验观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌的保护作用，研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理，旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病，开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。

　　1材料与方法

　　1.1动物模型制备及分组选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只，体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5mg·（100g） -1，麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［ 呼吸频率60 次·min-1，潮气量2ml·（100g）-1］，沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组（不做任何处理）;假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）;缺血再灌注损伤组（IR）（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ，再灌注120 min ）;当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg ， 其它处理同缺血/ 再灌注组）。

　　1.2主要试剂25%当归注射液（武汉大学中南制药厂）;即用型兔抗鼠p53单克隆抗体， 即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1常规HE染色

　　1.3.2免疫组织化学S-P法检测p53相关抗原主要步骤:5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，p53采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4 ℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为p53的阳性对照组。

　　1.4免疫组织化学结果判断① p53以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。② 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对p53抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.5统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和 q检验，检验水准α 为0.05。

　　2结果

　　2.1HE染色正常对照组:可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常。假手术组:可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常。缺血再灌注损伤组:可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂。当归治疗组:可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。

　　2.2p53的表达正常对照组:心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，p53表达极弱或无表达;假手术组:心肌细胞内可见极少量的棕黄色颗粒，p53表达极弱;缺血再灌注损伤组:心肌细胞内有较多棕黄色颗粒，p53表达强;当归组:心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，p53表达极弱或无表达。图像分析结果显示:正常对照组: p53蛋白表达的平均光密度为1.476±0.043;假手术组: p53蛋白表达的平均光密度为1.183±0.094;缺血再灌注损伤组: p53蛋白表达的平均光密度为4.861±0.775;当归治疗组:p53蛋白表达的表达的平均光密度为1.357±0.024。正常对照组: p53蛋白表达的阳性面积率为0.173±0.012，假手术组: p53蛋白表达的阳性面积率为0.156±0.018;缺血再灌注损伤组: p53蛋白表达的阳性面积率为0.509±0.063;当归治疗组:p53蛋白表达的表达的阳性面积率为0.147±0.018。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义（ P <0.05）。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间p53蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（ P <0.01）;正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义（ P >0 05）。见表1。

　　表1 当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组p53蛋白表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注:正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较， P <0.001;△ 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较， P >0.05。

　　3讨论

　　心肌缺血再灌注损伤（ ischemia reperfusion injury， IRI ）在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用。近年来研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。赵明中等［3］研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡，同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围。心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显著增多。近年来凋亡机制参与心肌缺血再灌注损伤成为临床研究的热点。细胞凋亡（apop tosis）是细胞死亡形式之一，是有核细胞在一定条件下启动其自身内部机制，通过内源性DNA内切酶的激活而发生死亡的过程。越来越多研究表明，心肌缺血/再灌注（ I/R）损伤与细胞凋亡密切相关。当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明，当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用。在心血管疾病中，经常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是多因素的，但主要有三个环节:即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成，其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因［4］。缺血再灌注过程中，机体可通过多种途经产生氧自由基，氧自由基与生物膜发生一系列反应，可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜， 产生大量的脂质过氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤慨念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚，但巳经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。已经证实，人类心肌梗死除细胞坏死外，细胞凋亡也参与了梗死的病理过程，细胞凋亡不仅影响梗死面积，而且促成心脏结构的重构，心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［5］。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。细胞凋亡区别于细胞坏死的一个显著特征即受基因调控，心肌缺血/再灌注损伤时细胞凋亡也同样受基因调控。近年来人们发现p53与细胞凋亡有密切关系。正常的p53基因即野生型p53基因（wt-p53）与突变型p53基因（mt-p53）均参与细胞凋亡的调节。野生型p53基因能诱导白细胞的凋亡，突变型p53则抑制细胞凋亡。齐丽彤等［6］应用Wistar大鼠结扎左冠状动脉45min再灌注4h，观察到缺血-再灌注过程中心肌细胞p53表达增加。Kirshenbaum等研究心肌细胞凋亡的分子调节机制，结果证实p53基因为心肌细胞凋亡的激活因子，并且指导促凋亡基因Bax的转录，而且由p53激活的心肌细胞凋亡可以被抗凋亡基因Bcl-2所阻断，支持了Bcl-2是一个强有力的抗凋亡因子［7，8］。细胞凋亡受基因调控，表现为凋亡信号通路的启动和相关基因的表达［9］。在各种因素刺激下，参与心肌细胞凋亡的调控基因有所不同。凋亡信号的刺激可通过细胞内酶促联级反应，活化特异性核酸内切酶和转录因子，引起细胞凋亡的形态与生化变化，同时还可活化凋亡调控基因的表达。我们的实验结果显示，正常对照组、假手术组及当归治疗组p53表达极弱或阴性表达，缺血再灌注损伤组p53表达呈强阳性。p53基因过度表达能促进心肌细胞凋亡。本研究中， p53在缺血再灌注损伤组表达增加 ，因此可以认为p53的过度表达是心肌细胞凋亡的机制之一。而当归治疗组p53表达极弱或阴性表达，说明当归注射液均有明显改善心肌缺血及再灌注心功能及细胞损伤作用，与改善微循环、血液流变学、减少钙超载、抗氧化自由基损伤 有关。缺血再灌注损伤本身是个多因素协同的过程，缺血再灌注组织发生细胞凋亡的机制也是一个多因素的过程，心肌细胞坏死与细胞凋亡有着一些共同的始动因素，如氧自由基、钙离子超载、细胞因子的释放、中性粒细胞侵润等既可以引起细胞凋亡，也可以引起细胞坏死。无疑通过各个环节对抗细胞凋亡必然也会对抗细胞的坏死起一定的作用。现在对心肌缺血再灌注引起细胞凋亡的确切机制尚未阐明，对抗心肌细胞凋亡的治疗也大多处于动物试验阶段，特别是基因治疗离临床应用还有一段距离。从以上的实验结果和讨论来分析当归注射液为防治缺血再灌注损伤的应用具有重要的研究意义，并且为加强心肌保护作用提供重要的理论依据。并进一步证实缺血后处理对再灌注心肌细胞具有抗凋亡作用， 提示缺血后处理的心肌保护。

【】
  　　1 魏蕾，欧阳静萍，王雄，等. 当归对高分子右旋糖酐诱导人红细胞聚集性增强的影响. 微循环学杂志，2001，11 （1） :30～31.

　　2 袁新初，张端莲. 当归注射液对更年期大鼠超氧化物歧化酶和脂质过氧化物的影响.中草药，2001，32 （9） :822～823.

　　3 赵明中，陈运贞. 大鼠实验性心肌缺血再灌注时细胞凋亡的动态变化及意义. 基础医学与临床，2000，20（1）:52～55.

　　4 Komai H ， Rusy BF.Effects of inhibition of transsar colemmal cal-ciam inlux by nickel on force of postrest contraction on contracture inducde by rapid colling. Cardiovase Res ， 1993， 27 : 801.

　　5 戴瑞鸿，李勇，范维琥，等. 保护内皮细胞功能在防治心血管疾病中的重要性. 国际心血管杂志， 2000，2 （4） : 328.

　　6 齐丽彤，张钧华，李大元，等.血管紧张素Ⅱ-Ⅰ型受体阻断剂抑制大鼠缺血-再灌注模型心肌细胞凋亡. 中华心血管病杂志， 2001，29 （2） : 118～121.

　　7 Parlakpinar H， Sahna E. Protective effect of caffeic acid pheneth-ylester （CAPE） on myocardial ischemia-reperfusion induced apop-toticcell death. Toxicology， 2005，209（1）:1～14.

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