Bcl?2和bad蛋白表达与皮肤血管瘤的相关性研究
【摘要】 目的： 探讨bcl?2和bad基因在血管瘤组织中的表达及相关性。方法： 采用免疫组织化学方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中bcl?2和bad基因的表达水平。 结果：Bcl?2在增生期血管瘤内皮细胞的表达明显高于退化期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P＜0.01）；Bcl?2在退化期血管瘤内皮细胞的表达与正常皮肤组织血管内皮细胞相比，差异无显著性（P＞0.05）。bad在退化期血管瘤内皮细胞的表达明显高于增生期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞（P＜0.01）。结论： bcl?2和bad参与了血管瘤的发生、和退化；Bcl?2通过抑制内皮细胞凋亡而促进血管瘤的增生；bad通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。
【关键词】 bcl?2； bad； 血管瘤； 凋亡； 免疫组织化学
皮肤血管瘤是好发于婴幼儿的一种常见良性肿瘤。内皮细胞过度增殖和血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点，也是血管瘤发生的实质。根据内皮细胞生长、摄取 3H?胸苷、肥大细胞计数、纤维细胞形成以及脂肪浸润等将血管瘤分为：增生期、退化期和退化完成期三个时期，但至今其病理演变的确切机制仍不十分清楚。近年来研究表明血管瘤是一种血管过度形成的良性肿瘤，血管内皮细胞的过度增殖和血管形成在血管瘤病理演变过程中起着很重要的作用，而关于影响血管内皮细胞的过度增殖和血管形成因素的研究越来越引起科研工作者的重视。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Bcl?2和bad是在调控细胞凋亡过程中的比较重要的蛋白质，它们在许多恶性肿瘤中的研究比较多，而在血管瘤这种良性肿瘤中的研究，尤其是在血管瘤不同时期表达的研究，国内外尚未见报道。本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了Bcl?2和bad在血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤血管中的表达，以探讨Bcl?2和bad在血管瘤由增生向退化转变过程中的作用机制。
1 材料和方法
1?1 材料
1?1?1 材料来源 收集武汉大学人民病理科2002~2006年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性25例，女性25例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性。
1?1?2 材料分组 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色和免疫组织化学S?P法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤28例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。
1?2 主要试剂和仪器
1?2?1 主要试剂即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；即用型兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；浓缩型鼠抗人bad单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；浓缩型鼠抗人Bcl?2单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；超敏即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1?2?2 主要仪器 YWY781型医用微波仪(浙江临安器材厂)；家用高压锅。
1?3 方法
1?3?1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色
1?3?2 免疫组织化学S?P法检测bad、Bcl?2、PCNA和Ⅷ因子相关抗原主要步骤：① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ bad、Bcl?2采用微波抗原修复（3档，10min），PCNA采用高压抗原修复，Ⅷ因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（bad， 1: 150；Bcl?2，1:50)37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，人扁桃体作为bad、Bcl?2的阳性对照，人正常皮肤表皮作为PCNA的阳性对照。
1?4 免疫组织化学结果判断 Bcl?2、Bcl?2和Ⅷ因子相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PCNA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Bcl?2和的bad表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1?5 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2?1 HE染色正常皮肤组织中的毛细血管由1~2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见内皮细胞增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染；内皮细胞有的围成血管腔，有的不围成血管腔而呈团块状。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞数量减少，内皮细胞核扁平；血管腔增大，血管间结缔组织增多。有时在同一个标本中，可以同时见到典型的增生期和退化期区域。
2?2 PCNA的表达增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA表达强。退化期血管瘤内皮细胞核扁平，大多数细胞核被苏木精染成蓝色，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA表达弱。
2?3 Ⅷ因子相关抗原的表达增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。
2?4 Bcl?2的表达增生期血管瘤内皮细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒；退化期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积。图像分析结果显示见表1。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q 检验，增生期组与退化期组之间、增生期组与正常皮肤组之间，Bcl?2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01)，退化期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05），见表1。
表1 血管瘤不同时期Bcl?2表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 增生期组与退化期组比较， P＜0.01；△ 增生期组与正常皮肤组比较，P＜0.01；# 退化期组与正常皮肤组比较，P＞0.05 。
2?5 bad的表达退化期血管瘤内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒较多；增生期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒。图像分析结果显示见表2 。经q 检验，退化期组与增生期组之间、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01) ，增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)，见表2。
表2 血管瘤不同时期bad表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 增生期组与退化期组比较，P＜0.01；△ 退化期组与正常皮肤组比较， P＜0.01；# 正常皮肤组与增生期组比较，P＞0.05。
3 讨论
血管瘤（hemangiomas）是一种血管过度形成的良性肿瘤，好发于婴幼儿。由于所观察的人群及年龄段不同，血管瘤的发病率有很大的差异，通常在1%~2%之间［1,2］。不同种族﹑性别及家族史的存在与否都影响着血管瘤的发病率，高加索人的发病率高于有色人种［3］。对于大多数患者，血管瘤经过一个增生期后会停止生长并逐渐消退，但仍有部分患者的血管瘤可持续或因其生长部位特殊而具有一定的危险性，持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症，而位于颜面、颅内及口腔的血管瘤可引起明显的畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康。临床上通常将血管瘤分为毛细血管瘤、海绵状血管瘤、蔓状血管瘤和混合型血管瘤，其中毛细血管瘤又进一步分为葡萄酒色斑和草莓状血管瘤，这种分类方法将临床表现作为分类依据，没有根据细胞生物学特性进行区别，它给方式的选择带来混乱。1982年，Mulliken和Glowacki［4］根据血管瘤病变的临床表现及组织学特点将其分为两大类，即血管瘤（hemangiomas）和血管畸形(vascular malformation),并且根据内皮细胞生长﹑摄取 3H?胸苷、肥大细胞计数、纤维细胞形成以及脂肪浸润等将血管瘤分为：增生期（Proliferative phase）、退化期(Involuting phase)和退化完成期(Involuted phase)三个时期。随着此分类法的出现，人们开始正确认识这种疾病。虽然血管瘤各期的组织形态学特征已经通过免疫组织化学方法鉴定出来，但至今其病理演变的确切机制仍不十分清楚。血管瘤是一种血管形成性疾病，血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三个阶段，病理表现主要为：在增生期血管瘤内皮细胞过度增生，表现出胚胎性内皮细胞特性，瘤组织中发生稠密的新血管形成，在未知因素的控制下，血管瘤从增生期转变为退化期直至退化完成期，内皮细胞增生逐渐停止，大量内皮细胞趋向凋亡，而原先形成的新生血管逐渐成熟并随后转向退化。国内外学者对血管瘤增生和发展的临床及细胞特征进行了大量研究，发现了许多影响血管形成的正性和负性因子均与血管瘤的病理发展有关，同时确定了一些促进血管瘤内皮细胞异常增殖的生长因子和激素。这些成分包括各种血管形成因子、细胞外基质成分、蛋白酶及其抑制物、雌激素、自由基、NO等，它们对内皮细胞迁移、分化、血管样结构形成以及细胞间的相互作用等都起着重要作用。近年来研究表明［5,6］，血管内皮细胞的过度增殖和血管形成（angiogenesis）在血管瘤病理演变过程中发挥重要作用。 我们在近几年的研究中,对血管瘤的发生、发展的病理机制进行了一系列研究，我们认为在血管瘤病理发生过程中，存在血管内皮细胞本身生理、生化和基因的异常；而血管瘤由增生向退化转变的原因则是细胞间的信号传递和内皮细胞内基因表达的改变。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Iwata［6］等证实了血管瘤组织中存在较高的细胞凋亡率。Razon等［7］报道应用TUNEL法测定，发现在增殖期血管瘤中细胞凋亡水平低，而在退化期血管瘤中凋亡水平则升高5倍，免疫荧光双标记实验表明至少1/3的凋亡细胞是内皮细胞。程立新等［8］报道Bcl?2这一凋亡抑制因子在海绵状血管瘤及蔓状血管瘤组织中的表达较毛细血管瘤中的表达高。根据我们实验室的多年研究及报道，依据血管内皮细胞的生物学特点并结合临床，将传统的命名血管瘤分为血管瘤和血管畸形。毛细血管瘤是属于血管瘤类型，而海绵状血管瘤和蔓状血管瘤属于血管畸形，因此可以推测为什么血管瘤会自发消退而血管畸形却不会消退。Clusterin /apoJ是一种与凋亡有关的多功能糖蛋白，Hasan等［9］应用RT?PCR和免疫组织化学技术研究表明在血管瘤由增殖期向退化期的转变过程中，Clusterin /apoJ的转录和蛋白表达水平均增高，且定位于肥大细胞，因此设想是肥大细胞合成、释放Clusterin /apoJ使血管瘤消退。近来研究表明，许多细胞因子可诱导血管内皮细胞凋亡，如TGF?β［0］、IFN?α［11］、血管抑素（angiostatin）［12］、内皮抑素（endostatin）［13,14］等。Bcl?2是B 细胞淋巴瘤/白血病?2基因的缩写,它于1984年由Tsajimato等从滤泡性淋巴瘤中分离出来。目前已知Bcl?2家族有大约15个成员,按其功能可分为抗凋亡的Bcl?2亚族(包括Bcl?2、 Bcl?xL、Bcl?w、Mcl?1、Nr?13等)和促凋亡的Bax亚族(包括Bax、 Bak、 B id、Bad、 Bik、 Bnip s等) , Bcl?2和Bax是其中最重要的成员［15,16］。对新近发现的bcl?2 家族基因bad 研究中发现,bad 也可与bcl?2抗凋亡蛋白形成异二聚体,而调控细胞凋亡。bad 是首先从鼠的cDNA文库克隆鉴定出的促凋亡基因,其后又克隆出人的同源基因,它属于bcl?2家族成员。双杂交和序列分析显示,bad与bcl?2和bcl?xL结合,具有促进凋亡作用,故名bad ( bcl?xL/ bcl?2?associated death promoter) ,它存在bcl?2家族成员BH?3同源结构域和序列。与bax、bak、bcl?2和bcl?xL相似,BH?3结构域是bad与bcl?2家族蛋白结合所必需的,突变的bcl?2和bcl?xL不能与bax、bak 结合,而bad却可以与它们结合［17,18］ 。过去已知bad的促凋亡作用依赖于与bcl?2 或bcl?xL结合,bad 必须与bcl?xL结合诱导凋亡,细胞外的bad 通过与一种细菌毒素的转运结构域结合进入细胞, 诱导凋亡。最近Hong等［19］发现,bad在某些病毒感染时可与病毒受体结合,可能通过酪氨酸激酶途径激活细胞凋亡。因此, bad作为调控细胞凋亡的重要成员,其在肿瘤中的研究一直受到重视。bad在多种肿瘤中的表达具有重要的意义。Ichinose 等［20］发现,bad蛋白磷酸化后失活,失活后的bad 可加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化。Kohler等［21］则发现,bax和bad的高表达与急性白血病的预后不良相关,可以作为一个预后指标。在bcl?2和bcl?xL过表达的情况下,bad可直接诱导凋亡,具有治疗意义［22］; 在直肠癌组织中,bad、bcl?2的异二聚体减少有助于癌的进展,促凋亡的bax和bad与抗凋亡的bcl?2和bcl?xL竞争性结合形成二聚体调节凋亡［23］ 。本研究表明：Bcl?2在增生期血管瘤内皮细胞的表达高于退化期，bad在退化期血管瘤内皮细胞的表达高于增生期，差异有显著性（P＜0.01)。在血管瘤增生期，Bcl?2表达占优势，bad低表达，可以形成Bcl?2/Bcl?2同源二聚体和少量Bcl?2/ bad异源二聚体，而这两种二聚体存在时起抑制细胞凋亡，维持细胞存活的作用。增生末期bad开始表达，随着bad表达的逐渐增多，以及Bcl?2表达的减少，至退化期bad表达占优势，形成bad / bad同源二聚体增多，诱发细胞凋亡。综上所述，在血管瘤增生期早期，由于Bcl?2表达占优势，抑制细胞凋亡，加之促血管生成因子的作用，结果使得内皮细胞以增殖为主，而凋亡较少；至增生期末bad开始表达，并逐渐增多，而Bcl?2表达减少，加之促血管生成因子的减少，结果使得内皮细胞凋亡增多，而增殖减少，血管瘤由增生转为退化，直至完全消退。
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