NO和iNOS在大鼠糖尿病早期肾脏中的变化

【摘要】  目的：观察糖尿病大鼠早期肾脏中一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase ，iNOS）活性变化，探讨NO/iNOS 在糖尿病早期肾脏损害中的作用机制。方法：取成年健康SD大鼠60只，随机分成糖尿病组（DM组）和正常对照组（NC组）,每组30只。DM组大鼠采用一次性腹腔内注射STZ制造糖尿病大鼠模型，成模后和NC组分别于第1、2、4周麻醉取左肾，用硝酸还原酶法和吸光光度法测定肾组织中NO含量、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和iNOS活性。所有数据用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。结果：① DM组大鼠肾组织中NO含量、NOS和iNOS活性分别较同批NC组有显著性差异（P<0.05）；②各组大鼠中NO含量与NOS活性、iNOS活性呈正相关。结论：糖尿病大鼠早期肾脏中iNOS活性增强，催化生成的NO在糖尿病早期肾脏损害中发挥重要作用。

【关键词】  诱导型一氧化氮合酶； 糖尿病； 一氧化氮； 一氧化氮合酶

　　细胞信号传递系统NOS?NO在糖尿病肾损害的发病机制中起重要作用。NOS是 NO合成的限速酶，是调节 NO的最重要环节。目前已经证实肾脏中 NOS有三种亚型，神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）、诱导型（iNOS）。nNOS和iNOS分布于胞浆，eNOS存在于细胞膜。iNOS作为NOS三种亚型中最特殊的一种亚型近些年来成为许多研究者热衷的课题，它的活性不依赖于Ca/CaM（钙/钙调蛋白），而需要诱导因子如内毒素、γ?干扰素、白介素?1等存在。所以，iNOS仅在受到免疫或细胞因子刺激时才被激活，引起NO长期大量释放，参与病理生理过程。目前在糖尿病肾病中iNOS变化倍受关注，许多学者对糖尿病肾脏中的iNOS进行了研究，但结论存在较大的争议，尚无统一定论。本实验通过建立大鼠糖尿病模型，用硝酸还原酶法和吸光光度法，动态观察大鼠糖尿病早期肾脏中NO含量和iNOS活性变化，探讨NO和iNOS在糖尿病早期肾损害中作用机制。

　　1  实验材料

　　1?1  主要试剂链脲佐菌素（STZ）购于美国Sigma公司；NO测试盒（A012） 、NOS组织试剂盒和iNOS组织试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯。

　　1?2  主要仪器TGLL?18G台式高速冷冻离心机 （江苏泰昌公司）；UV751GD紫外/可见分光光度计 （上海）；DY89?Ⅰ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝科器研究所）；SHZ?88 水浴恒温振荡器（江苏金坛）。

　　1?3  实验动物成年健康SD大鼠60只，雌雄不限，体重200～220g（由辽宁医学院实验动物中心提供）。

　　2  方法

　　2?1  动物模型的建立取上述SD大鼠60只，随机分成正常对照组（NC组）和糖尿病组（DM组），每组30只。标准颗粒饲料喂养，不限食水。室内通风良好，相对湿度40%～70%，室温18℃～22℃。DM组大鼠按50mg/kg 体重一次性腹腔注射STZ溶液，同时，NC组一次性腹腔注射等体积生理盐水，连续监测鼠尾血糖3d，持续血糖浓度>13.8mmol/L者，确定为糖尿病模型。此后定期监测鼠尾血糖。

　　2?2  肾组织匀浆制备DM组大鼠成模后，与NC组大鼠分别于成模后第l、2、4周取右肾，沿横轴切割组织块约0.2g～1g，入冰生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸滤干，称重后放入5ml烧杯内。用移液管取总量生理盐水（生理盐水体积总量应该是组织块重量的9倍）于烧杯中，用眼科小剪剪碎组织块（烧杯放入冰水中进行）。用组织捣碎机10000~15000rpm上下研磨制成10%肾组织匀浆（匀浆时间每次10s，间隙30s，连续3～5次，在冰水中进行）。

　　2?3  肾组织NO含量、NOS和iNOS活性测定

　　2?3?1  肾组织蛋白含量测定  将上述10%肾组织匀浆静置30min，冷冻离心机（3000rpm）离心10min，留取上清液。按照蛋白含量测定说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取595nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值1），代入以下公式，出肾组织蛋白含量。蛋白含量（g/L）＝测量管OD值1     标准管OD值1× 标准管浓度（g/L）

　　2?3?2  肾组织NO含量测定  按照NO测试盒说明书加入试剂，再利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取550nm，0.5cm光径）测量各样本吸光度值（OD值2），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出肾组织NO含量。  NO含量（μmol/gprot）=　测量管OD值2-空白管OD值2  标准管OD值2-空白管OD值2×标准品浓度(20μmol/L)／样本的蛋白含量(gprot/L)

　　2?3?3  肾组织NOS活性测定  按照NOS组织试剂盒说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取530nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值3），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出肾组织NOS活性。NOS活性（U/mgprot）=
NOS测定管OD值3-空白管OD值3     呈色物纳摩尔消光系数×反应液总体积     取样量×1     比色光径×反应时间／蛋白含量(mgprot/L)

　　2?3?4  肾组织iNOS活性测定  按照iNOS组织试剂盒说明书加入试剂，利用UV751GD紫外/可见分光光度计（选取530nm，1cm光径）测量各样本吸光度值（OD值4），与测得的各样本蛋白含量代入以下公式，计算出iNOS活性。iNOS活性（U/mgprot）=　iNOS测定管OD值4-空白管OD值4     呈色物纳摩尔消光系数×反应液总体积     取样量×1     比色光径×反应时间／蛋白含量(mgprot/L)以上3项生化指标具体操作均按说明书进行。

　　2?4  统计处理所有统计资料用均数±标准差（±s）表示。应用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析。统计方法：DM组与NC组大鼠之间采用配对t检验；DM组大鼠各病程之间采用单因素方差分析，并进行q检验；NO与iNOS活性、NOS活性间进行相关分析。所有资料在分析之前进行方差齐性检验。

　　3  结果

　　3?1  肾组织NO含量、iNOS和NOS活性变化NC组大鼠肾脏中NO含量及iNOS和NOS活性在第1、2、4周经单因素方差分析，差异无显著性（P>0.05）。DM组大鼠各病程肾脏中NO含量及iNOS和NOS活性与同批NC组均有显著性差异（P<0.05）:① DM组大鼠各病程中NO含量及iNOS和NOS活性单因素方差分析，差异有显著性（P<0.05）；②DM组大鼠肾脏NO含量及NOS活性随病程进展呈先降后升变化。第1周DM组大鼠肾脏NO含量及NOS活性显著低于同批NC组（P<0.05），以后逐渐升高，在第2、4周显著高于同批NC组（P<0.05）；③DM组大鼠肾脏中iNOS活性随着病程进展，呈先升高后降低的变化趋势， iNOS活性在第2周大鼠肾脏中显著高于第1周和第4周病程组（P<0.05）。见表1，图1~3。

　　表1  大鼠肾脏NO含量、iNOS和NOS活性变化（略）

　　注：* 与同批NC组相比较P<0.05； #与DM 2周组比较P<0.05。
  
　　图1  大鼠肾组织NO含量变化直方图（*与同批NC组比较，P＜0.05）（略）

　　图2  大鼠肾组织iNOS活性变化直方图（*与同批NC组比较，P＜0.05）（略）
  
　　图3  DM大鼠NO含量、NOS和iNOS活性变化直方图（略）

　　3?2  肾组织NO与NOS活性、iNOS活性相关分析DM、NC各组大鼠肾脏中NO含量与NOS活性、iNOS活性具有呈正相关关系(P<0.05)，见表2。

　　表2  各组大鼠肾NO与NOS活性、iNOS活性的相关性（略）

　　4  讨论

　　无论是糖尿病病人或糖尿病动物模型，在疾病的早期都可能存在肾脏的高灌注和高滤过，但发生这种肾血流动力学异常的原因尚未完全阐明［1，2］。iNOS作为 NO合成的限速酶，在糖尿病发生不同时间活性发生变化。本实验通过吸光光度法测量了NC和DM大鼠早期各病程中的iNOS活性变化，结果显示，iNOS在NC组大鼠肾组织中持续处在低活性状态；而在DM组迅速上升，第2周活性最强，第4周活性下降但仍显著高于NC组大鼠，随病程进展呈先升高后降低的动态变化。这种变化的原因可能系：DM时高血糖可使细胞外扩容，肾血管切应力增加；DM初期一些细胞因子如白介素?1、肿瘤坏死因子?α、干扰素?γ产生增加；DM时氨基酸代谢紊乱，尤其是甲基胍增加，这3方面因素通过多种途径作用增强iNOS的活性［3］。随着糖尿病进展糖基化终末产物增加（AGEs）、氧自由基及多元醇通路的代谢产物增多，又使iNOS的活性降低［4］。由于iNOS可利用L?精氨酸合成NO，故其活性的增加必然导致合成NO的量增多。这点在相关分析中也得到了证实。NO是调节肾脏血流动力学的重要因素，抑制NO产生可使肾小球入球小动脉收缩，肾血浆流量（RPF）、肾小球滤过率（GFR）下降。NO对肾血流动力学的调节是多途径的。首先NO可直接作用于血管平滑肌，使血管张力降低。此外，NO还可抑制管球反馈（TGF）［5］。当TGF被激活时，肾小球入球小动脉收缩，RPF、GFR下降；反之，入球小动脉舒张。从本实验结果表1、图1、图2和图3可以看出，NO量与NOS活性始终呈同步变化，但与iNOS活性变化却并不完全一致。DM大鼠第1周肾组织中NO含量和NOS活性下降，iNOS活性却上升；第2、4周时NO含量和NOS活性同步上升时，而iNOS活性又开始下降。其原因可能是由于NOS的3种同工酶都参与了此时催化合成NO作用。第1周，DM大鼠肾脏中nNOS 活性显著降低抵消了iNOS和cNOS活性增强的作用，出现此期的肾组织中NO含量和NOS活性下降，iNOS活性却呈现上升的现象。随后nNOS不再发生变化，NOS主要表现iNOS和cNOS活性增强的作用，于是出现第2、4周时NO量、NOS活性、iNOS活性均上升。到DM第4周iNOS表达和活性虽有所下降，但cNOS活性仍处于继续上升阶段，所以NO量和NOS活性依然处于上升趋势［6，7］。因而也推测，iNOS在DM大鼠早期肾脏中并非全程都发挥主要催化NO的作用，而是从第2周才开始。另外，iNOS被激活后生成NO能持续相对较长时间（几小时到几天），不同于cNOS与nNOS活性增强合成的NO寿命极短（几秒到几分钟）［8，9］，因而iNOS被激活催化生成的NO具有更强的损伤作用。但目前研究方法还很难将3种同工酶生成的NO完全分离开，有待于进一步探讨。总之，本研究结果提示糖尿病早期肾脏中iNOS被激活，且呈先升高后降低的变化，生成大量的NO，在糖尿病早期的肾脏损害中发挥了重要作用。

【】
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