基质细胞衍生因子-1α及其受体CXCR4在急性白血病的表达及与髓外浸润的关系
【摘要】 为了探讨基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）及其受体CXCR4在急性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三系白血病的表达及与髓外浸润的关系，对66例急性白血病中的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者组（31例）、急性粒细胞白血病（M2）患者组（20例）、急性单核系细胞白血病（M4+M5）患者组（15例）、髓外浸润患者组（41例）、非髓外浸润患者组（25例），应用酶联免疫吸附实验（ELISA）及流式细胞术分别检测SDF-1α及其受体CXCR4在三组白血病外周血及骨髓白血病细胞上的表达。结果表明：ALL患者组、M4+M5患者组、M2患者组及正常对照组血浆的SDF-1α水平分别为1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55 (pg/ml)，其中ALL患者和M4+M5患者组高于M2患者组，但均明显低于正常对照组（P＜0.01）。髓外浸润患者组及非髓外浸润患者组SDF-1α血浆水平分别为1252.49±263.12、1234.91±185.50，（pg/ml），组间无显著差别。CXCR4在ALL患者组、M4+M5患者组、M2患者组白血病细胞上表达的平均荧光强度（MFI）为78.47±33.96、67.21±24.29、41.66±17.18，ALL患者组及M4+M5患者组明显高于M2患者组（P＜0.05）。ALL患者组、M4+M5患者组间无显著性差别。髓外浸润患者组CXCR4表达的MFI（81.72±27.63）明显高于非髓外浸润患者组（36.94±11.86）（P＜0.05）。结论：急性淋巴细胞、单核细胞系白血病细胞趋化因子受体CXCR4高表达可能是其易发生髓外浸润的分子机制，3组白血病患者外周血SDF-1α表达水平均降低且与髓外浸润无明显相关，髓外浸润可能更取决于受浸润脏器局部SDF-1α表达水平。
【关键词】 急性淋巴细胞白血病
Expression of SDF-1α and Its Receptor CXCR4 in Acute Leukemias and Their Relationship with Extramedullary Infiltration
Abstract The study was aimed to explore the expression of stromal cell derived factor-1α(SDF-1α) and its receptor CXCR4，and their relationship with the extramedullary infiltration in acute lymphoblastic，grannulocytic and monocytic leukemia. 66 cases of acute leukemia included 31 cases of acute lymphoblatic leukemia (ALL)，20 cases of acute grannulocytic leukemia (M2) and 15 cases of acute monocytic leukemia (M4+M5). There were 41 cases with extramedullary infiltration and 25 cases without-extramedullary infiltration. Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) and flow cytometry were used to determine expression of SDF-1α and CXCR4 respectively on leukemia cells in peripheral blood and bone marrow of different groups. The results showed that average plasma level of SDF-1α in the ALL，M4+M5，M2 patients and the normal control were 1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55 （pg/ml） respectively. The average levels in the ALL，M4+M5 and M2 patients groups were lower than those in normal control group. Both levels in ALL and M4+M5 patient groups were higher than that in M2 patient group. The average levels of SDF-1α in patient group with extramedullary infiltration and patient groups without-extramedullary infiltration were 1252.49±263.12，1234.91±185.50 （pg/ml） respectively. The former seemed as if higher than the latter，but without statistical significance. The MFI of CXCR4 expression in ALL，M4+M5，M2 patient group were 78.47±33.96，67.21±24.29，41.66±17.18， respectively. CXCR4 expression in ALL and M4+M5 patient groups were higher than that in M2 patient group (P＞0.05). There was no significant difference between the ALL and M4+M5 patient group (P>0.05). The MFI of CXCR4 expression in patients with extramedullary infiltration and patients without extra-medullary infiltration were 81.72±27.63，36.94±11.86 respectivehy. The former was higher than the latter(P<0?05). It is concluded that the higher expression of CXCR4 on acute lymphoblatic and monocytic leukemia cells may be one of the molecular mechanisams of extramedullary infiltration in both kinds of leukemia. The average plasma levels of SDF-1α decreased in leukemia patients and this decrease not related to the extramedular infiltration，which may be due to the SDF-1α local expression in the organ infiltrated.
Key words acute lymphoblastic leukemia；acute grannulocytic leukemia；acute monocytic leukemia；stromal cell derived factor-1α；CXCR4；extramedullary infiltration
白血病是恶性克隆性疾病，广泛浸润骨髓、肝、脾及淋巴结等器官。尽管Reiter等［1］报道外周血白血病细胞数量反映体内白血病细胞负荷的多少，与髓外浸润的严重程度相关，但其具体机制并不清楚。白血病髓外浸润是一个复杂的病理过程，包括白血病细胞的趋化、黏附、迁移、异位器官侵袭、生存、增殖及抗凋亡等多个环节。有关白血病细胞上黏附因子受体的表达与髓外浸润的研究较多［2，3］，而对髓外浸润与趋化因子及其受体的表达的关系国内尚未见报道。基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor -1，SDF-1α）是首先发现于骨髓基质细胞培养上清的趋化性细胞因子，其受体CXCR4为G蛋白偶联受体，属于趋化因子亚家族CXC成员之一，二者特异结合，参与造血生成、胚胎造血迁移、胚胎发育、组织再生、塑造、伤口愈合及肿瘤细胞的转移和恶化等一系列生理、病理过程的调节。我们应用流式细胞术检测白血病细胞表面的趋化因子及其受体CXCR4的表达，并探讨二者与髓外浸润的关系。
材料和方法
病例选择和分组
所有病例取自本院血液科门诊及住院的初治急性白血病患者，66例，分组如下。
依据1986年FAB制定的MIC分型标准划分为：①急性淋巴细胞白血病（ALL）31例，其中男20例，女11例，平均年龄23.71±19.28岁，L1 1例，L2 29例，L3 1例；②急性非淋巴细胞白血病（单核细胞系M4+M5）15例，男9例，女6例，平均年龄39.67±17.52岁，M4 4例，M5 11例；③急性非淋巴细胞白血病（粒细胞系M2）20例，男12例，女8例，平均年龄31.86±13.25岁。
依据髓外浸润的症状分为髓外浸润组和非髓外浸润组。髓外浸润的判断：体检及B超检查出现下列体症之一即为髓外浸润组：皮肤结节（病理证实为白血病细胞浸润），牙龈增生，肝、脾、淋巴结肿大，中枢神经系统浸润。本研究66例患者中髓外浸润41例，男18例，女23例，平均年龄28.74±19.16岁；其中ALL 23例，M2 7例，M4+M5 11例。非髓外浸润25例，男14例，女11例，平均年龄32.13±17.35岁；其中ALL 8例，M2 13例，M4+M5 4例。
正常对照组10例，男6 例，女4例，平均年龄35.0±12.0 岁。
仪器试剂
FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品），SVNRISR全自动酶标仪（澳大利亚Ges.M.B.H.TECAN公司产品）。4520 S/N17918-455摇床（美国Forma Scientific InC公司产品），Biofuge Stratus，Heraeus台式高速低温离心机（德国贝克曼公司产品）。-80℃冰箱（日本Sanyo产品）。-20℃冰箱（新飞公司产品）。CD2、CD7、CD19、CD20、CD38、CD33、CD34、CD117单克隆体抗为Becton Dickinson公司产品，TdT、CD5、CD10、CD13、CD14、CD64单克隆抗体均为PharMingen公司产品，PE标记CXCR4单克隆抗体及小鼠同型Ig2α对照购自R&D公司。SDF-1α酶联免疫吸附实验试剂盒（购自R&D公司，灵敏度为18 pg/ml）包括：覆盖SDF-1α单克隆抗体96孔板，SDF-1α结合液21 ml，SDF-1α标准品100 ng，检测稀释液RD1-55 11 ml，校正稀释液RD6Q 21 ml，显色剂A 12.5 ml，显色剂B 12.5 ml，停止反应液6 ml，清洗缓冲液20 ml，胶带4张。淋巴细胞分离液，小牛血清白蛋白（BSA），叠氮钠，肝素钠（12 500 U），Dubicol缓冲液。
CXCR4的检测
采用双色荧光标记法，以新鲜骨髓标本常规白血病免疫分型，同样标本以淋巴细胞分离液梯度密度离心获单个核细胞，以预冷的含0.5%的BSA、0.1%叠氮钠的PBS(Dubicol)洗2次（1 000转/5分钟）。调细胞浓度至4×106/L，取上述细胞悬液50 μl，分别加入PE标记的CXCR4单克隆抗体和小鼠Ig2α同型对照。4℃冰箱内放置40分钟，以PBS(Dubicol)离心洗去多余未结合的抗体，加入400 μl PBS 上机检测。各测定管用FACSort流式细胞仪CellQuest软件以对数（log）取样，每管获取并分析10 000个细胞。通过前向角光散射（forward scatter，FSC）和侧向角散射（side scatter，SSC）设门（R1），以排除碎片和死细胞。再用CD45/SSC设门分析R1内细胞，依据细胞的抗原表达及细胞的颗粒性识别各群细胞。判别正常细胞与异常细胞群进行重点分析。依据CellQuest软件32分析细胞表面的MFI。
SDF-1α检测
血浆标本的收集和处理 收集骨髓标本同时取肝素抗凝的外周静脉血1.5 ml，30 分钟内离心，1 000×g离心15分钟，取上层血浆在-4℃条件下以10 000×g进行第2次离心10分钟，留取上层血浆置-80℃冰箱冻存。正常对照组取自门诊检查并排除恶性血液病的就诊者外周静脉血（肝素抗凝）1.5 ml，标本处理方法同上。
血浆SDF-1α浓度的酶联免疫吸附检测
主要步骤如下：①复温：将所有试剂及标本温度恢复至室温；②标准曲线的制作：取试管8个，分别编号1-8，于1管中加入900 μl校正稀释液，2-8管分别加入500 μl校正稀释液。将1ml三蒸馏水加入100 ng SDF-1α标准品中，充分混匀，终浓度为100 000 pg/ml，取100 μl上述浓度标准品加1管中，混匀后以移液枪吸取500 μl移入2管，再次混匀，依次移入3-7中，8为空白对照管；③于ELISA微孔板中每孔加检测RD1-55稀释液100 μl；④每孔加标准品或样本100 μl，混匀，以胶带封闭，固定至摇床上（500 ±50 rpm）室温下孵育2小时；⑤ 配制清洗缓冲液：以量筒量取480 ml蒸馏水，以吸管加入浓缩稀释液20 ml至500 ml，玻棒混匀待用；⑥每孔加入400 μl上述清洗缓冲液，混匀，弃去液体，以洗水纸吸干，重复洗4次；⑦每孔加200 μl SDF-1α结合液，以胶带覆盖，重复放置摇床上孵育2小时；⑧每孔加入400 μl上述清洗缓冲液，4次；⑨配制底物作用液：取A液、B液等量混匀于小烧杯中，避光保存；⑩每孔加200 μl上述混合液，室温下避光放置30分钟；○11每孔加50 μl停止作用液，混匀；○1230分钟内以全自动酶标仪分别在570 nm和540 nm波长处测量吸光度（A），测量值A=A540 nm-A570 nm。在读取A值，重复检测2次，取均值。○13以标准品的不同浓度及相应的A分别取对数后回归分析，求出回归方程：=3.525±0.936X，相关系数r=0.980（t=4.130，P＜0.001）。根据回归方程以实验所得A值求出样品浓度，进行统计学分析。
统计方法
两均数比较用t 检验，多个均数比较应One Way-ANONY，3组以上均数间两两比较应用最小显著差（LSD）t检验，统计均用SSPS 10.0医学软件。
结 果
SDF-1α在各型白血病中的表达
ALL、M4+M5、M2三组急性白血病患者外周血浆SDF-1α的表达均低于正常对照组。ALL、M4+M5组间无显著性差别(P＞0.05)，但均高于其在M2组血浆中的表达水平(F=10.97，P＜0.05） (表1)。Table 1. SDF-1α expression in different leukemia groups and normal control group（略）
CXCR4在各型白血病中的表达
ALL、M4+M5组骨髓白血病细胞上CXCR4表达的MFI高于M2组（LSD检验：均数间MD分别26.583，36.217；P分别为0.021，0.001），ALL组、ANLL（M4+M5）组间比较无统计学差异(均数间MD为0.410，P=0.410)（表2）。Table 2. CXCR4 expression in different leukemia groups（略）
SDF-1α/CXCR4在髓外浸润组和非髓外浸润组的表达
急性白血病髓外浸润组和非髓外浸润组外周血浆SDF-1α水平的比较无显著性差别(P＞0.05)，而髓外浸润组骨髓白血病细胞上CXCR4的表达明显高于非髓外浸润组（P＜0.01）（表3）。Table 3. SDF-1α/CXCR4 expression in extramedullary infiltration and non-extramedullary infiltration patients（略）
SDF-1α/CXCR4与外周血白血病细胞的数量的相关性分析
3组急性白血病患者外周血浆SDF- 1α的表达同外周血白血病细胞计数间无明显相关（Pearson检验，r=-0.197，P＞0.05），而骨髓中白血病细胞上CXCR4的表达与外周血白血病细胞计数呈正相关（Pearson检验，r=0.628，P＜0.01）。
讨论
髓外浸润是白血病细胞的重要生物学特点，髓外浸润的过程可能与淋巴细胞的归巢和白细胞的游走有相似的机制，体内白血病细胞总是趋向于能提供的适宜其生长的特定条件、表达特定的趋化因子，并能捕获或吸引血流中表达其特定受体的组织或器官，这是一个有序的、复杂的、有器官选择性的病理过程，除黏附因子外，趋化因子及受体在此过程中也可能起重要作用。在造血干细胞归巢的研究中发现，SDF-1α不仅是正常造血干/祖细胞的趋化因子，也是分化受阻的白血病细胞的趋化因子［4］，其影响白血病趋化能力与白血病细胞上其受体CXCR4的表达有关。
CXCR4表达在多种白血病细胞上，与白血病细胞在血髓的分布和扩散有关。Mohle等［4］用RT-PCR技术发现，所有的白血病细胞系及原代白血病细胞均表达CXCR4 mRNA，体外试验表明CD34+白血病细胞同CD34+造血干细胞一样在Transwell体系中向高浓度SDF-1α方向迁移，这证明细胞虽已恶性转化，但仍保持着趋化因子受体的功能，是影响白血病细胞体内迁移的重要生物学基础。Voermans 等［5］和Mohle等［6］在体外实验中发现，白血病细胞的迁移能力与细胞表面的CXCR4的表达呈正相关，而与白血病细胞的大小、生长周期无关，高度表达CXCR4的白血病细胞迁移能力明显增强，这证明趋化因子受体的表达是影响白血病细胞体内播散的重要因素。
本研究应用流式细胞仪检测分析了66例成人急性淋巴细胞、急性单核细胞及急性粒细胞三系白血病细胞的免疫分型及趋化因子受体CXCR4的表达，结果发现CXCR4在急性淋巴细胞白血病细胞、急性单核系白血病细胞上高表达，而在粒细胞系白血病细胞上表达相对减弱。这与临床上淋巴细胞、单核细胞两类白血病易合并髓外浸润的症状相一致。本研究结果显示，CXCR4在髓外浸润组的表达率明显高于非髓外浸润组，提示CXCR4表达上调可能是导致髓外浸润发生的原因之一。这与Crazzolara等［7］在小儿ALL的临床研究一致。相关性分析表明，CXCR4的表达同外周血白血病细胞数呈正相关，提示除反映白血病的容量负荷外周白血病细胞数量外，趋化因子受体CXCR4的表达也是髓外浸润发生的重要条件，是预测髓外浸润发生的敏感生物学指标。这种趋化因子受体表达的上调可能是恶性克隆细胞获得多脏器广泛浸润的生物学特性的生物学基础，是“功能多余性”表现［8］，也是肿瘤异质性特征之一，而趋化因子受体表达的上调及其与配体的相互作用可能是白血病髓外浸润发生的分子机制之一。同时发现在CXCR4及外周血白血病细胞数均减低时仍有9例发生髓外浸润（本文未报），说明除趋化因子外，其他细胞因子如黏附因子也在白血病的髓外浸润发生中起重要作用。
SDF-1是CXCR4的配体，不仅产生于骨髓基质细胞，也产生于肝、脾、淋巴结、肾、脑等多种组织器官，并通过参与黏附分子1的激活［9］，提高基质金属蛋白酶（MMP）活性，降低组织型金属蛋白酶抑制剂（TMP）的活性，特异性地降解细胞外基底膜的Ⅳ型胶原［10］，促进白血病细胞趋化、黏附、穿出血管壁，进入血管外组织，形成恶性克隆的浸润。SDF-1α在肝、脾、淋巴结、中枢神经系统及内皮细胞高表达而在肾脏组织血管内皮细胞低表达［11］，后者白血病细胞浸润相对少见，这可能是导致白血病时各脏器髓外浸润症状不均衡的重要原因之一。本研究首次发现：3种细胞系急性白血病患者的SDF-1α的血浆水平明显低于正常对照组，但与外周血白血病细胞数量及髓外浸润的发生无明显相关，可能与白血病时恶性克隆在骨髓中异常增生，使骨髓基质细胞生长相对受抑，SDF-1α分泌水平减少有关，也可能与白血病时其他细胞因子如TGF使骨髓基质细胞中SDF-1α的mRNA的表达下调有关［12］。外周血中SDF-1α的水平可能与外周血白血病细胞数量及髓外浸润的程度无关，而髓外浸润症状的发生可能更取决于各脏器局部SDF-1α的水平。SDF-1α是一种生长刺激因子，通过增加bcl-2的表达促进白血病细胞生长、增殖及抗凋亡能力的调节。应用抗SDF-1α单克隆抗体可以加速肿瘤细胞的凋亡，减缓肿瘤的生长［13］。由此可见，骨髓基质细胞及髓外组织内产生SDF-1α不仅促进白血病细胞的局部浸润，而且也是使其在局部生长、增殖的保护因子，是髓外浸润得以发生、的重要条件。在完全缓解期，随基质细胞功能的恢复，髓外浸润器官中SDF-1α可能是残留的白血病细胞得以生存的原因及导致白血病复发的根源。
统计分析还表明：ALL、M4+M5组SDF-1α的血浆水平高于M2组，在3组白血病骨髓基质功能均受抑时，急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病患者血浆中SDF-1α水平的升高提示，在急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病中除SDF-1α的旁分泌作用外，可能同时存在两系白血病细胞的自分泌作用。Cignetti等［14］应用RT-PCR技术发现，ANLL，M4，M5细胞表达SDF-1α的mRNA，ALL细胞的体内自分泌作用目前尚未见报道，有待于进一步研究。
由上可见，SDF-1α/CXCR4系统在白血病中表达水平并不一致，可能主要是通过CXCR4表达的上调发挥其生物学效应的，其失衡的机制有待于进一步探讨。进一步研究二者在相互作用及转录调控机制，有可能为以CXCR4为靶点的白血病提供新的思路。
【】
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