搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究
作者：迟占有，姜华，谭文松，戴干策，赵春华
【摘要】 为进一步提高脐血造血细胞的扩增倍数并达到临床规模，本研究中利用自主开发的有溶氧和pH控制的搅拌式生物反应器进行了脐血造血细胞的换液培养。结果表明，培养中总细胞、CD34+细胞、各系集落形成细胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的扩增倍数均高于方瓶培养，而且由于控制了较低的溶氧，所培养细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶培养。该反应器中培养的脐血造血细胞达到了临床应用的规模。结论：反应器中培养环境更有利于干/祖细胞的维持和扩增，而且可达到成人造血干细胞移植所需细胞量。
【关键词】 脐血
Ex vivo Culture of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Cells in Stirred Tank Bioreactor with feeding protocol
Abstract To increase the expansion multiple of cord blood (CB) hematopoietic cells and to reach a scale for clinical application，the mononuclear cells from CB were cultured in a autonomously developed stirred tank bioreactor with dissolved oxygen (DO) and pH controlling. The result showed that the expansion multiple of total cells，CD34+ cells，and progenitors cells (CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，and CFU-Mk) in bioreactor were greater than that in T-flasks. The rate of progenitors to total cells in bioreactor culture was also greater than that in T-flasks. The good results in bioreactor should be attributed to the controlled，optimized DO. Clinical-scale culture was realized from one sample of CB in this bioreactor. These results suggested that the culture environment in bioreactor with optimal DO and pH controlling is more favorable for stem/progenitor cell maintenance and expansion，and the expanded cells from one sample of CB is enough to transplant for an adult patient.
Key words cord blood；hematopoietic cell；bioreactor；stirred culture
脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个重要造血干细胞来源，在临床上有着广泛应用，但脐血中造血干细胞的绝对数量少，无法满足成人的移植要求，而通过体外培养和扩增有望克服这一矛盾。体外扩增骨髓细胞、外周血细胞、脐血细胞的临床实验都已有所报道［1，2］，证明了体外扩增后细胞用于临床的安全性和可行性。目前开发的体外扩增造血干细胞的培养系统主要有平板灌注腔反应器、固定床和流化床反应器、搅拌式反应器等［3］。其中搅拌式生物反应器能提供均一的培养环境，而且取样和数据采集简单，易于实现自动控制，因此，在造血细胞临床规模培养中有较好的应用前景［3，4］。本研究应用自主开发的搅拌式生物反应器系统，进行脐血造血细胞的换液培养研究。
材料和方法
脐血(CB)和单个核细胞(MNC)的分离
脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、发育良好的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养液洗涤2次。
培养基和细胞因子
体外培养液用IMDM（Gibco公司），使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml）、G-CSF（2.0 ng/ml）和GM-CSF（2.0 ng/ml），其中SCF、IL-6购于北京宝赛生物技术公司，IL-3购于Pepro-Tech公司，G-CSF购于上海三维制药厂，GM-CSF购于上海海济生物技术有限公司。
造血细胞的反应器换液培养
将分离得到的脐血单个核细胞以2×106 cells/ml的密度在 T-175方瓶中培养4天后，再接种到反应器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中进行培养，进行的2次实验中接种密度均为0.8×106 cells/ml。反应器为自主开发产品，其中反应器中所用材料经过造血细胞的生物相容性检验，反应器工作体积为300-500 ml，搅拌系统为磁力搅拌，转速控制为30 r/min。反应器的温度控制为37℃，溶氧和pH通过调节空气、氮气、氧气和二氧化碳的流量来控制，通气方式为表面通气。pH控制在7.15，溶氧控制为饱和溶解空气的25％。细胞接种到反应器后，待细胞密度生长至2.0×106 cells/ml后进行换液，即取出50％的细胞液，并加入相同体积含有相同细胞因子的新鲜培养液。实验中以T-25方瓶作对照，每瓶装液7 ml，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，方瓶与反应器中换液比例和频率相同。
细胞计数及活性分析
台盼蓝染色后利用血球计数器进行活细胞和总细胞的计数，由于实验中很少能见到被染成蓝色的细胞（死细胞），因此，未进一步细胞活性。
造血细胞的集落检测
集落的检测体系为IMDM培养液，添加20％胎牛血清（FBS），4 mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纤维素(4 000cp，Sigma)，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、 EPO，其浓度分别为50、20、20、20、20 ng/ml和2 U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培养或没培养的单个核细胞加入0.5 ml集落培养液中，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养12天后，进行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix计数，其中CFU-Mix为至少含有粒细胞和红细胞的集落。
CFU-Mk的检测采用血浆块法，细胞以1×105 cells/ml的接种密度接种于24孔板中，每孔加50 μl脐血浆，50 μl 3.4 g/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO （20 ng/ml）、IL-3（10 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）的α培养基（Gibco公司），混匀后静置凝固。培养10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脱水，并固定30分钟，然后按次序加入1% BSA、鼠抗人CD41抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、抗生物素蛋白-碱性磷酸酯酶复合物（加入后都要作用一定时间，然后用0.05 mol/L Mtris/NaCl缓冲液淋洗3遍，再加入其它试剂），染色后在40×目镜下观测呈红色的集落。
细胞表型分析
流式细胞仪分析中所用抗体为PharMingen公司产品。取1.0×106未扩增或扩增后的细胞加入1.5 ml离心管中，用PBS洗2遍，离心后倒掉上清液，加PE偶联的小鼠抗人CD34单克隆抗体和FITC偶联的小鼠抗人CD45单克隆抗体各10 μl，4℃孵育30分钟。PBS洗2遍，离心后，每管加1 ml FACS保存液；标记抗体后的细胞用流式细胞仪（Becton Dickinson公司）分析，结果用Lysis II软件处理。
结 果
总细胞的扩增
由图1可见，换液培养时，总细胞在18天的培养中一直维持扩增，在开始的14天中反应器和方瓶中总细胞扩增倍数相差不大，14天后开始有所差别，说明培养到后期方瓶中细胞增殖潜力不如反应器。扩增到18天时，两批实验反应器中总细胞分别扩增37.2倍和26.3倍，方瓶低于反应器中扩增倍数。
干/祖细胞的扩增
CFU-Mix由于具有多向分化潜能，代表了较原始的干/祖细胞，换液培养中CFU-Mix扩增情况如图2所示，两次实验反应器中CFU-Mix的扩增分别在第10天和第9天达到最大，扩增倍数分别为7.7和8.9，方瓶中第7-8天达到最大，而后逐渐下降，其扩增倍数明显低于反应器中。反应器中培养至14天仍可检测到CFU-Mix，而方瓶中10天后仅能检测到很少的CFU-Mix。
CFU-GM的扩增在14天左右达到最大，而后维持数天，或有所下降，而方瓶中扩增倍数在第10天达到最大，而后开始较快下降，而反应器中CFU-GM扩增倍数一直高于方瓶，最大扩增倍数分别为27.4和23.6，显著高于方瓶（图2）。
BFU-E达到最大扩增倍数的时间较早，在7天左右，由于本实验中没有添加EPO，所以BFU-E的扩增倍数不高，由图2可以看出，反应器中扩增倍数一直高于方瓶。
反应器中CFU-Mk的扩增倍数在10天时达到最大，而后逐渐下降，14天后基本检测不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天达到最大后就开始较快地下降。扩增最大时，两次实验反应器中分别扩增10.3倍和14.4倍（图2）。
培养中CD34+细胞的扩增如图3所示，反应器扩增倍数一直上升，至14天时达到最大，方瓶培养到第7天时与反应器相差不大，第10天开始有较大差异，第14天的扩增倍数比第10天时提高不大。由图看见最终反应器中CD34+细胞的扩增倍数高于方瓶培养。
反应器培养的规模
附表显示了2次实验中反应器培养的规模，由附表可见，如果不取出细胞而采用流加方式培养细胞，则培养到12天时，第1次实验中可得到2.44×109总细胞、4.88×106 CFU-Mix、11.9×106 CFU-GM和59.5×106 CD34+细胞，第2次实验可得到2.03×109总细胞、3.53×106 CFU-Mix、9.0×106 CFU-GM、和36.7×106 CD34+细胞。
造血干细胞移植中细胞需要达到的理想量是总细胞3.7×107 cells/kg，和CFU-GM 2.0×105 cells/kg，CD34+细胞2.5×106 cells/kg。按此，对于1个50公斤体重的病人总细胞、CFU-GM、CD34+细胞必须分别达到1.85×109、 10×106、和125×106 个。我们的检测中是作同一集落分析而分别计数CFU-GM 和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的细胞，因此，这两个数字应该相加再与中所述的CFU-GM量相比才是的，从总细胞和集落形成细胞数来说，反应器培养所得细胞可达到理想量的要求。CD34+细胞数虽然小于理想量，但也可满足最低量25×106细胞的要求。因此，如果利用该反应器一直补料培养，可以从一份脐血培养得到足够用于临床的细胞量。
讨 论
造血干/祖细胞移植目前在临床中主要用于造血干/祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各类自身免疫病、及实体瘤的，是一种重要的细胞治疗手段。脐血造血干/祖细胞作为一种造血干/祖细胞来源，
由于数量较少，在临床上只能用于儿童患者，要应用于成人患者则必须通过体外扩增增加其数量，其中培养环境中的溶氧、pH、细胞因子、培养方式等对扩增效果有重要影响。因此，要实现造血干细胞体外扩增技术在临床上应用，需要开发出足够大规模、标准化的培养系统以及相应的扩增工艺。本研究采用搅拌式生物反应器在临床规模扩增了脐血单个核细胞，扩增得到的细胞中代表造血干/祖细胞的CD34+细胞、CFU-GM、CFU-Mk等细胞的含量均较常规的静态培养高，更适于临床应用。而且，其培养规模达到了临床应用中所需移植细胞量的要求。
溶氧是造血细胞发育的重要调控因子，很多报道都表明，低氧分压（1％-5％）比正常氧分压（20％）有利于造血干/祖细胞的维持和扩增［6］，因此，我们在生物反应器中控制的溶氧为饱和空气的25%，这与5％氧分压相当。实验表明，反应器培养中不但细胞扩增倍数高，所得细胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+细胞的含量都高于方瓶培养的结果，而且维持时间比方瓶中长，这应该与反应器中所维持的低溶氧有关。
值得注意的是，在本系统中虽然在一定程度上可以减缓造血干/祖细胞的分化速度，但并不能从根本上解决培养过程中造血干/祖细胞的分化问题。另外，本实验中所检测的各类集落形成细胞及CD34+细胞都仅能代表造血祖细胞，因此其扩增情况只能代表祖细胞的扩增，如果要确定造血干细胞是否真正实现了扩增，则需要进行SCID小鼠体内造血重建实验才能够确定。
Collins等［3］也用400 ml的有pH和溶氧控制的反应器进行了脐血造血细胞的培养，其2次实验中总细胞分别扩增了约35倍和200倍，而CFU-GM分别扩增了约23倍和30倍，我们的结果与之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的转瓶中进行了骨髓造血细胞的培养，培养中只添加细胞因子组合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，结果总细胞和CFU-GM只扩增了8倍和5倍。在此基础上添加基质细胞条件培养基显著提高了总细胞的扩增，CFU-GM扩增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我们的实验中所添加的细胞因子为IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都较小，分别为5 ng/ml、2 ng/ml、2 ng/ml，这对防止细胞过早分化有一定作用。如果在此基础上进一步优化培养基，如添加基质细胞条件培养基或FL和TPO等能促进干细胞增殖的细胞因子等，有望进一步提高造血干/祖细胞的增殖。
除造血干/祖细胞外，为缩短粒细胞和血小板的恢复期，以及为放疗和化疗提供辅助治疗，临床中对粒细胞、巨核细胞、红细胞等成熟细胞的需求也很大，因此，培养成熟细胞也是造血细胞体外扩增的重要内容之一。Neildez-Nguyen等［8］在体外培养红细胞前体细胞的实验中所培养的总细胞数达1010个，这些前体细胞在输入小鼠体内后可分化为成熟的红细胞，对于如此大规模的成熟细胞培养，应用搅拌式生物反应器将更有优势。
【文献】
1Jaroscak J，Goltry K，Smith A，et al. Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo-expanded UCB cells: results of a phase I trial using the AastromReplicell System. Blood，2003；101: 5061-5067
2McNience I，Briddell R. Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells and mature cells. Exp Hematol，2001；29: 3-11
3Cabral J M S. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells in bioreactors (review). Biotechnology Letters，2001；23: 741-751
4Collins PC，Miller WM，Papoutsakis ET. Stirred culture of peripheral and cord blood heatopoietic cells offers advantages over traditional static systems for clinically relevant applications. Biotechnol Bioeng，1998；59: 534-543
5Collins PC，Nielsen LK，Patel SD et al. Characterization of hematopoietic cell expansion，oxygen uptake，and glycolysis in a controlled，stirred-tank bioreactor system. Biotechnol Prog，1998；14: 466-472
6Hevehan DL，Papoutsakis ET，Miller WM. Physiologically significant effects of pH and oxygen tension on granulopoiesis. Exp Hematol，2000；28: 267-275
7Kim Byung-soo: Production of human hematopoietic progenitors in a clinical-scale stirred suspension bioreactor. Biotechnology Letters，1998，20: 595-601
8Neildez-Nguyen TM，Wajcman H，Marden MC，et al. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat Biotechnol，2002；20: 467-472
