紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用
作者：郭春龙 黄艳丽 朱晓敏 张春阳 冯禄 王赞滔 姜华茂
【关键词】 紫杉
摘要：目的：探讨紫杉醇体外抑制膀胱癌EJ细胞株及诱导凋亡的作用。方法：体外培养膀胱癌EJ细胞株，以不同浓度紫杉醇处理12～72h后， 通过MTT法测定细胞生长抑制作用，采用电镜观察和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：紫杉醇能抑制EJ细胞的生长，并在一定剂量和时间范围内呈现出明显的时间、浓度依赖关系。电镜下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成花瓣形。电泳见出现典型的凋亡DNA梯形带。结论：紫杉醇能抑制膀胱癌EJ细胞株的生长，诱导凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。
关键词：紫杉醇；膀胱癌；细胞凋亡
膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，手术切除是膀胱癌的首选方法。但是膀胱癌的易复发性常使单纯采用手术疗法难以获得满意疗效，应用化疗作为辅助治疗手段可望减少肿瘤患者的复发率，提高其生存率。紫杉醇（Paclitaxel，商品名：Taxol）是从紫杉树皮中提取的一种新型抗微管广谱抗癌药，具有特异性地稳定细胞微管的作用［1］。本研究旨在体外观察紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株的抑制和诱导凋亡作用，以探讨紫杉醇对膀胱癌的临床应用价值。
1 材料与方法
11 试剂
紫杉醇由上海华联制药有限公司提供，临用前稀释至所需浓度；RPMI1640培养基(含10％胎牛血清，青霉素及链霉素各100U/ml)；L谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠1mmol/L购自华美公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司。
12 细胞培养
人膀胱癌EJ细胞株购自上海午立生物有限公司，培养于含有10％胎牛血清，100 U/ml青霉素、链霉素的培养基中，在37℃、5％ CO2培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。
13 实验分组
对照组：不加药，每天更换1640全培养液。实验组：紫杉醇浓度分别为10、50、100、500nmol/L，接种细胞24h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。
14 细胞毒性分析
应用MTT比色法测定不同浓度紫杉醇对EJ细胞增殖的影响，并绘制剂量效应曲线。将对数生长期的EJ细胞以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，细胞数为2×104/ml接种于96孔培养板。接种细胞24h进入对数生长期后开始加入不同终浓度的紫杉醇，每浓度设4个复孔，并设对照孔。置于37℃含5％ CO2孵箱中分别培养12、24、48、72h后每孔加MTT（5mg/ml）20μl。作用4h后弃上清，各孔加入100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。细胞生长的抑制率（％）＝（对照组A值－实验组A值）/ 对照组A值×100％［2］。
15 透射显微镜观察
取对照组及实验组细胞（细胞数量为106～107）倒出瓶中培养液，用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）洗3min×3次，后加入2.5％戊二醛4℃放置10min。用接种环刮下细胞移入离心管中，2000r/min离心15min。用接种环刮起细胞块，将细胞块与戊二醛一起转移到青霉素小瓶中，4℃放置2h。用PBS洗3min×3次（注意加液时一定不要冲散细胞团块），1％锇酸在4℃固定1h。PBS洗3min×3次，脱水（50％、70％、80％、90％、100％乙醇各1次 15min/次；100％丙酮2次，10min/次）。吸弃瓶中的脱水剂，加3ml纯丙酮EPON812包埋剂（1：1体积比），室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml室温放置2h或过夜。吸混合包埋剂2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注意混合包埋剂，置37℃、45℃分别12h，置60℃ 24h，修块，制备半薄切片，定位后制备超薄切片，醋酸铅铀染色，透射电镜观察。
16 DNA提取及电泳分析
取对数生长期的EJ单细胞悬液2×106个接种于培养瓶内，24h后待细胞进入对数生长期开始加入不同浓度的紫杉醇，培养48h收集贴壁及悬浮细胞，1000r/min，离心5min，弃培养液，再加入1mlPBS重悬细胞移入1ml微量离心管中，1000r/min，离心5min弃上清。加入50μl细胞裂解液，混匀，于37℃水浴至混合物变得清亮。在高速冷冻离心机中－4℃ 12000/min，10min，将上清转移至另一微量离心管中。以等体积的苯酚/氯仿（1：1），苯酚/氯仿/异丙醇（25：24：1）和氯仿各抽提一次。在上清中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的无水冷乙醇，于－20 ℃沉淀过夜。在－4℃ 12000r/min离心10min。收集将沉淀溶入20μlTBE缓冲液，加入1μl RNA酶，37℃保温1h。加入4μl样品缓冲液，混匀，立即加到含有0.4μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶的样品中，室温，于1×TBE缓冲液中5V/cm电压下电泳1h。以标准品100bp DNA lader为对照。紫外分析仪观察实验结果并拍照［3］。
2 结果
21 MTT结果
随培养基中紫杉醇浓度的增加和培养时间的延长，EJ细胞增殖明显受抑制。50～500nmol/L组作用一定时间后均可产生较强的抑制效应。其中100nmol/L和500nmol/L组分别于72h、48h达到IC50，提示紫杉醇对EJ细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性，见图1。
22 电镜结果
对照组细胞呈梭形，细胞增殖活跃，内可见多个细胞核，染色质分布均匀。实验组细胞体积缩小，细胞变圆，细胞核染色质发生边集，固缩，在细胞核膜周边聚集形成新月体形或花瓣形，密度增强，细胞膜保存完整，在细胞膜表面微绒毛消失，见图2。
23 电泳结果
对照组基因组条带由于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。紫杉醇为10nmol/L浓度组，由于紫杉醇浓度较低，未出现典型的DNA梯形带。紫杉醇在50nmol/L以上浓度组作用后出现典型的DNA梯形带，见图3。
3 讨论
紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药，它可促进微管双聚体装配成微管，又可防止微管解聚，这种稳定性作用可抑制微管正常的力学重组，影响细胞的正常分裂，同时紫杉醇与微管蛋白结合十分稳定，从而抑制细胞内外某些调控因素对微管系统的作用，可诱导细胞最终以凋亡方式死亡［4］。此外，尚可激活宿主的巨噬细胞，通过释放免疫因子调节机体免疫功能。临床应用表明，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌等有效，尤其对耐常规药物的肿瘤也取得了较好疗效。
细胞凋亡是一种相对于细胞坏死主动的程序化的细胞死亡形式。许多因素包括化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡，因此，细胞凋亡为肿瘤提供了新的思路和靶点。许多化疗药物均能不同程度地诱导细胞凋亡，肿瘤细胞凋亡敏感性是影响化疗效果的重要因素，如何诱导细胞凋亡已成为新的化疗目标［5］。本实验通过MTT法观察到紫杉醇能明显抑制EJ细胞的生长，而且在一定剂量范围内具有时间和浓度依赖性。紫杉醇浓度为50nmol/L时即有明显抑制作用。在100nmol/L和500nmol/L组分别于72h和48h达到IC50，但同时我们在倒置显微镜下观察到在500nmol/L作用72h时有少量细胞，细胞膜破裂形成颗粒状无定型碎片，呈坏死改变，说明随着紫杉醇浓度的增大和作用时间的延长，它的细胞毒性也增加。我们认为紫杉醇浓度为100nmol/L时为诱导EJ细胞凋亡比较理想浓度。电镜下可见在紫杉醇作用后，细胞体积缩小，细胞变圆，细胞核染色质发生边集、固缩，在细胞核膜周边聚集，形成新月形，电子密度增强，细胞膜保存完整，呈现出典型的细胞凋亡改变。电泳见对照组未出现DNA梯形带，而紫杉醇为10nmol/L浓度组由于凋亡细胞较少也未出现典型的DNA梯形带。紫杉醇在50nmol/L以上浓度组均出现典型的DNA梯形带，它们大都出现在200bp附近(图3)，证明紫杉醇作用后，细胞内内源性核酸酶活性增高，将核小体之间DNA切割形成规则的大片段以及180～200bp的多聚体。并且随紫杉醇浓度的增大，DNA梯形带越明显。说明紫杉醇诱导EJ细胞凋亡具有浓度依赖性，诱导细胞凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。这为今后紫杉醇用于膀胱癌治疗提供理论依据。
1 Long HJ. Paclitaxel(Taxol):a novel anticancer che motherapeutic drug.Mayo Clin Proc,1994,69:341~345
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3 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000,252~254.
4 Milas L,Hunter NR,Kurdoglu B,et al.Kinetics of mitotic arrest and apoptosis in murine mammary and ovarian turmors treated with taxol. Cancer Che mother pharmacol,1995,35(4):297~303.
5 刘天佑,曲欣,潘尚哈. 紫杉醇诱导体外培养胃腺癌细胞系SGC7901凋亡.哈尔滨医科大学学报,2003,37(3):215~217
