Chfr基因在急性白血病骨髓细胞中表达的研究
作者：龚辉，刘文励，周剑峰，冉丹，徐慧珍
【摘要】 为了探讨急性白血病（AL）患者骨髓细胞中有丝分裂早期检查点Chfr基因的表达及其意义，对46例初诊未的AL患者骨髓单个核细胞，用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测Chfr基因mRNA及蛋白的表达，并与正常人骨髓单个核细胞进行对照。结果表明：免疫组织化学和RT-PCR分析显示，28例急性髓细胞白血病（AML）中的15例，18例急性淋巴细胞白血病（ALL）中的13例骨髓单个核细胞Chfr基因mRNA和蛋白的表达与正常对照相比显著下降，同时Chfr基因表达异常病例染色体检查存在核型异常。结论： 急性白血病骨髓细胞有丝分裂检查点Chfr基因表达受损，可能在白血病发病中具有重要作用。
【关键词】 急性白血病
Analysis of Expression of Mitosis Checkpoint Gene Chfr in Bone Marrow Cells of Acute Leukemia Patients
Abstract This study was purposed to investigate the significance of mitosis checkpoint gene chfr expression in acute leukemia (AL). 2 ml of bone marrow were extracted from each of 46 AL patients and 10 normal donors as control and their mononuclear cells were isolated. Then，their chfr expression was detected by using RT-PCR and immunohistochemistry. Normal control blood samples were also analyzed. The results showed that in 15 out of 28 cases of acute non-lymphocytic leukemia and 13 out of 18 cases of acute lymphocytic leukemia expression of chfr gene mRNA and protein significantly decreased as compared with control. The cytogenetic analysis of patients with a decreased Chfr expression revealed abnormal chromosome. In conclusion，Chfr gene is a leukemia-related gene and may play an important role in leukemia pathogenesis.
Key words acute leukemia；mitosis checkpoint；Chfr gene；bone marrow cell
细胞在长期进化过程中出了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制，通常被称为细胞周期检查点（checkpoint）。后者也称M期检查点。既往对G2/M期检查点的研究较多，而对M期检查点研究较少，特别是以前发现的所有有丝分裂检查点基因（mitosis checkpoint gene）都不能很好地解释其与癌症发生之间的关系，Chfr是Scolnick等［1］于2000年发现的一个M前期检查点基因，定位于12q24.33。细胞存在有丝分裂应激时，Chfr通路激活延迟染色体凝集。目前认为chfr基因可能控制着最初的癌变过程，有作者［2-4］ 相继证实，Chfr基因与肿瘤相关，但与人急性白血病(AL)发病之间的关系目前不清楚。我们分析了46例急性白血病患者骨髓单个核细胞中Chfr基因的表达及可能的作用。
材料和方法
细胞系与病例
白血病细胞系HL-60由同济肿瘤生物医学中心马丁教授惠赠。培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，5％ CO2培养箱中培养。46例AL患者骨髓细胞标本来自本院血液内科住院初诊未治疗患者，诊断按张之南主编《血液病诊断及疗效判断标准》。其中AML 28例，ALL 18例，男24例，女22例，中位年龄32岁。按标准方案化疗判断疗效，分A、B两组，A组为部分缓解及未缓解，B组
为完全缓解。10例正常人骨髓来源于异基因骨髓移植的正常供者。
RNA提取及RT-PCR
AL患者于治疗前抽取骨髓3 ml，肝素抗凝，用Ficoll分离液分离出BMMNC。取BMMNC（1×106）细胞，应用TRIZOL试剂盒提取细胞总RNA，用AMV逆转录试剂盒合成cDNA，在20 μl总反应体积中含3 μl总RNA，42℃孵育1小时，65℃灭活AMV 5分钟，-20℃保存。RT-PCR试剂盒购自华美公司；PCR标准参照物(DGL-2000，北京鼎国公司)。TRIZOL试剂购自Gibco公司。PCR同时扩增Chfr和GAPDH，引物序列：〖5］ 并核对Gene Bank原始cDNA序列，经上海博亚生物工程公司鉴定并合成。Chfr： ① 5′-GGCGAGCGTTCCTCCAGTTG-3′，②5′-GCATGTCAGCGTCTCCTCCATCTTG-3′，产物306 bp；GAPDH: ① 5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，② 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′，产物为260 bp。在50 μl扩增体系中含cDNA 3 μl、10×buffer×(Mg2+)5 μl、Mg2+(25 mmol/L) 4 μl，1 μl dNTP(2 mmol/L)，Chfr，GADPH的上、下游引物50 pmol/ L。于94℃ 预变性5分钟，加入1 μl Taq酶(5 U/μl )，PCR循环：94℃变性 60秒，60℃ 退火60秒，72℃ 1分钟，共40个循环。每次扩增用HL-60细胞作阳性对照，并设立阴性对照。产物鉴定，取产物10 μl，2％琼脂糖凝胶(含0.5 mg/LEB)电泳，紫外灯下读结果并照相，胶片在凝胶成像系统中分析，以见到Chfr相应的扩增带为阳性表达，并以每条带面积乘以灰度作为表达量。在各样本之间以Chfr/GAPDH比值相比较。
Chfr蛋白水平表达的免疫组织化学方法检测
羊抗人Chfr多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司）的工作稀释度为1∶400，免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物公司。免疫组织化学法染色，HL-60细胞系为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。在油镜下看多个视野，共计数200个细胞，以细胞核出现黄色或棕黄色细颗粒为阳性细胞，细胞核被苏木精复染为蓝色被认为是阴性细胞，阳性细胞的比例<10%为（-），10%-25%为（+），26%-50%为（++），50%-100%为（+++）。
白血病细胞染色体制备及核型分析
将白血病患者骨髓细胞2×106/ml的密度接种于含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃温箱中培养24小时，然后加入终浓度为0.05 μg/ml的秋水仙酰胺，37℃孵育1小时后收获细胞。按照本实验室常规R显带法分析核型［5］。核型异常按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》［6］加以描述。
统计学处理
RT-PCR数据用x±SD表示，经SPSS 10.0统计软件分析，免疫组化结果采用秩和检验分析。
结果
BMNC中Chfr基因的mRNA表达水平
A、B组Chfr的表达结果经统计检验分析显示，A组与正常对照组相比，无显著性差异（t=0.831，P=0.42)；B组与正常对照组相比，有显著性差异（t=2.34，P=0.007）（表1）。28例AML中14例的Chfr基因表达与正常对照组相比显著下降。18例ALL中的13例比值与正常对照组相比显著下降（附图）。Table 1. Comparison of Chfr gene expression levels between AL patients and normal persons（略）
BMMNC中Chfr蛋白表达水平
免疫组织化学染色表明，Chfr在白血病组及对照组BMMNC的胞核与胞质中均有不同程度的表达。作为细胞周期检测点，作用部位在细胞核，胞质表达的意义目前尚不清楚，因此我们主要探讨Chfr在细胞核中表达情况。B组Chfr的表达阳性率低于A组和正常对照组，与正常对照组相比差异有显著性（P<0.01），但与A组相比差异无显著意义，A组Chfr的表达阳性率低于正常对照组，但差异无显著意义。
核型分析
10例Chfr基因表达降低病例染色体分析结果显示均出现核型改变。核型改变受累伙伴染色体分别为1号、2号、4号、7号、8号、11号、12号、17号、19号和22号染色体。其中有6例累及12号染色体，占受累伙伴染色体60％（表2）。Chfr基因定位于12q24.33，其表达异常可能与12号染色体移位有关。Table 2. Karyotype of 10 cases of AL with decreased Chfr expression（略）
讨 论
细胞周期检查点包括DNA损伤检查点和有丝分裂检查点，前者包括P53，P21，WAF1等。染色体的形成和分离是由Chfr，MAD1-3，BUB1-3等多个检查点控制，这些基因的特点是对有丝分裂时染色体凝集、中心体分离、纺锤体组装与染色体分离过程进行反馈式监控，使纺锤体正确形成，并与染色体结合。当存在有丝分裂应激时，Chfr通路激活，延迟染色体凝集和中心体分离，使细胞周期停滞于有丝分裂早期，而纺锤体不能形成，直至错误被纠正。如果这类基因出现突变、丢失等改变，细胞周期即使在这一过程有错误仍然不停顿地进行下去，导致染色体分离的紊乱和癌变。非洲爪蟾以及人Chfr基因控制染色体凝集和中心体分离［7，8］。已证实，Chfr基因与某些肿瘤如肺癌、结肠癌、胃癌直接相关［2-4］。
我们的研究证实，Chfr基因表达与急性白血病密切相关。在部分AL病例中，包括AML和ALL，Chfr基因表达显著下降或不表达，这提示在AL中Chfr基因可能存在缺失或突变，也可能在转录水平或转录后水平受到特异地调控，而使蛋白表达受到抑制。
染色体异常是肿瘤标志性特征，据报道90%以上急性白血病初诊时表现非随机性的染色体异常。本研究48例AL检测染色体核型分析中10例表现核型异常，他们都是Chfr基因mRNA和蛋白表达明显下降的病例，其中6例累及12号染色体。染色体凝集的细胞周期M前期检查点Chfr基因的表达异常可能会造成白血病细胞在进行分裂时染色体分离异常，导致非整倍体肿瘤细胞产生，并可能进一步引起其他方面的染色体异常。一方面部分白血病病例中核型异常可能与此有关；另一方面，白血病的发病也可能与Chfr基因表达在癌变的开始阶段发生改变有一定关系。有丝分裂早期检测点失常可以导致复制后的染色体在子细胞中分布不均，即产生非整倍体，并导致基因组不稳定性，进一步引起多基因突变。对于Chfr基因在白血病发病中的作用，尚有待进一步地进行突变检测、基因转染分析及细胞周期相关基因的分析研究。
【】
1Scolnick DM，Halazonetis TD. Chfr defines a mitotic stress checkpoint that delays entry into metaphase. Nature，2000；406(6794):430-435
2Mizuno K，Osada H，Konishi H，et al. Aberrant hypermethylation of the CHFR prophase checkpoint gene in human lung cancers. Oncogene，2002；21:2328-2333
3Corn PG，Summers MK，Fogt F，et al. Frequent hypermethylation of the 5’ CpG island of the mitotic stress checkpoint gene Chfr in colo- rectal and non-small cell lung cancer. Carcinogenesis，2003；24:47-51
4Shibata Y，Haruki N，Kuwabara Y，et al. Chfr expression is downregulated by CpG island hypermethylation in esophageal cancer. Carcinogenesis，2002；23:1695-1699
5薛永权. 介绍一种改良的骨髓细胞染色体热处理姬姆萨R显带法. 中华医学检验杂志，1986: 247
6Mitelman F，ed. An International System for Human Cytogenotic Nomenclature ISCN(1995). Basel:Karger. 1995
7Chaturvedi P，Sudakin V，Bobiak ML，et al. Chfr regulates a mito- tic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res，2002；62: 1797-1801
8Kang D，Chen J，Wong J，et al. The checkpoint protein Chfr is a li- gase that ubiquitinates Plk1 and inhibits Cdc2 at the G2 to M transition. J Cell Biol，2002；156: 249-259
