G-CSF动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响
作者：刘庆国，杨栋林，黄勇，姜尔烈，周世勇，何依，王志东，王玫
【摘要】 为了研究粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病（aGVHD）的影响，对20例供者G-CSF动员前后的外周血样品，加入佛波醇酯、伊能霉素、莫能霉素体外刺激培养4小时，以3色荧光标记法流式细胞术检测T细胞亚群Ⅰ（分泌INF-γ、INF-α）、Ⅱ型（分泌IL-4、IL-5和IL-10）细胞比例。结果表明： G-CSF动员前外周血CD3+IFN-γ+ 、CD4+IFN-γ+ 和CD8+IFN-γ+T细胞的比例分别为3.2% (0%-45.9%)、 1.3% (0%-23.8%)和1.5% (0%-22.2%)，G-CSF动员后前述细胞比例显著升高，分别为19.2% (0%-53.9%)、9.5% (0%-49.5%)和7.5% (0%-38.1%)。动员前CD3+IL-2+、CD4+IL-2+、CD8+IL-2+T细胞比例分别为1.5%(0%-31%)、0.8%(0%-30.0%)和0% (0%-5.3%)，动员后比例亦明显升高，分别为25.7% (0%-51%)、19.8% (0%-39.7%)、4.6% (0%-20.9%)。T细胞各亚群的IL-4阳性细胞比例在动员后升高不明显。移植早期aGVHD发生组供者的Tc1细胞比例显著高于无aGVHD组。动员后高Tc2比例组，其受者中、重度aGVHD的发生率明显低于低Tc2比例组（分别为20.0%和77.8%）。结论： G-CSF动员使供者外周血的I型T细胞比例增加，动员后高Tc1细胞比例与移植早期aGVHD发生相关，Tc2比例与中重度aGVHD发生率负相关。
【关键词】 G-CSF动员；T淋巴细胞亚群；移植物抗宿主病
Influence of G-CSF Mobilization on Functions of Donor T Lymphocyte Subpopulation and Acute Graft-versus-Host Disease
Abstract To investigate the influence of G-CSF mobilization on functions of donor T lymphocyte subpopulation and acute graft-versus-host disease，peripheral blood samples of 20 healthy donors were collected before and after G-CSF mobilization. The whole blood was diluted with IMDM in ratio of 1∶1 and then incubated with PMA +ionomycin+monensin at 37℃，5% CO2 for 4 hours. After being moblized and stained，the IL-4，IFN-γ and IL-2 positive cells were counted with three-color flow cytometry. The results showed that before G-CSF mobilization，the percentages of donor′s CD3+IFN-γ+，CD4+IFN-γ+，CD8+IFN-γ+ T cells were 3.2% (0%-45.9%)，1.3% (0%-23.8%) and 1.5% (0%-22.2%) respectively. The percentage of above mentioned cells in donor increased to 19.2% (0%-53.9%)， 9.5% (0%-49.5%)，7.5% (0%-38.1%) respectively after G-CSF mobilization. The IL-2 positive CD3+，CD4+ and CD8+ T cell percentage in pre-G-CSF mobilized donors was 1.5% (0%-31%)，0.8% (0%-30.0%) and 0% (0%-5.3%) respectively and subsequently increased to 25.7% (0%-51%)，19.8% (0%-39.7%)， 4.6% (0%-20.9%) respectively after G-CSF mobilization. The IL-4 positive T subpopulation did not increased significantly after G-CSF mobilization. In the early stage after peripheral blood stem cell transplantation，donor′s Tc1 percentage in aGVHD group was significantly higher than that in non-aGVHD group. The morbidity of severe aGVHD in high Tc2 percentage group was significantly lower than that in low Tc2 percentage group. It is concluded that the donor′s type I T cells increase after G-CSF mobilization，the Tc1 percentage of G-CSF mobilized donor is correlated with the occurrence of aGVHD in the early stage after HSCT，the percentage of Tc2 in donor is negatively correlated with aGVHD morbidity in recipients.
Key words G-CSF mobilization；T lymphocyte subpopulation；acute graft-versus-host-disease
急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的常见并发症，aGVHD的发生率高达30%-80%，发生aGVHD者因直接和间接原因而死亡的发生率可达50%［1］。aGVHD主要由T细胞介导，这个病理过程起始于移植物中供者T细胞与受者抗原相遇，随后供者T细胞识别受者抗原发生克隆性扩增，其不仅直接通过细胞毒作用对组织细胞进行攻击，并通过分泌细胞因子间接造成组织损伤。
根据细胞因子的产生，T淋巴细胞被分类为Ⅰ型和Ⅱ型T细胞。分泌IFN-γ、TNF-α的CD4+T细胞（Th1）和CD8+T细胞（Tc1）被认为是Ⅰ型T细胞，其在免疫应答过程中诱导细胞介导的免疫和迟发型免疫反应，在抗病毒和清除细胞内抗原方面发挥作用。分泌IL-4、IL-5和IL-10的CD4+T细胞（Th2）和CD8+T细胞（Tc2）被认为是Ⅱ型T细胞，其主要通过促使B淋巴细胞产生IgE和募集嗜酸、嗜碱粒细胞诱导过敏反应，在清除细胞外抗原方面发挥作用［2］。T细胞群的细胞因子谱可因刺激和所处微环境不同而转换为Ⅰ型或Ⅱ型免疫应答。在人类和小鼠的免疫系统中，Ⅱ型细胞因子能抑制T细胞增殖和Th1细胞因子的产生。由Th2分泌的IL-4具有抑制Tc1合成IL-2的作用，并能下调I型细胞的因子合成、细胞增殖和长期细胞毒性。虽然Tc1和Tc2细胞都具有细胞毒作用，但Tc2的细胞毒作用相对较弱。与Tc1分泌高水平IFN-γ并促进Th1细胞发育相反，Tc2分泌IL-4不仅对Th2细胞起促进作用并能抑制Th1细胞发育。因此，Ⅰ型和Ⅱ型T细胞相互调节，两者之间的平衡决定着细胞免疫和炎症反应的特征。
在造血干细胞移植中，绝大多数受者的aGVHD发生于T细胞免疫重建后，而由于放、化疗预处理及皮质激素应用导致了胸腺功能异常［3］，T细胞免疫重建有赖于移植物中成熟T细胞扩增［4］。因此，供者T细胞的免疫功能特征影响着受者移植后免疫。异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）的移植物中含有比骨髓移植物高10-20倍的T细胞，但aGVHD的发生率和严重度并无明显增加，而慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的发生率显著增高，提示供者T细胞功能在G-CSF动员后具有独特的特征。在本研究中，我们应用佛波醇酯（PMA）+伊能霉素（ionomycin)和莫能霉素(monensin) 刺激培养G-CSF动员前、后供者外周血标本，用流式细胞术检测T细胞亚群的Ⅰ、Ⅱ型细胞比例的变化，探讨供者T细胞亚群Ⅰ、Ⅱ型细胞的比例与aGVHD的相关性，以期有助于了解aGVHD的发生机制。
材料和方法
病例
标本取自2002年11月至2003年7月间在我院进行allo-PBSCT的20例患者。供者中位年龄46岁（21-63岁），其中女13例，男7例；受者中位年龄31岁（14-46岁），其中女4例，男16例。患者疾病类型包括急性淋巴细胞白血病5例（第1次完全缓解期2例，第2次完全缓解期 2例，部分缓解1例），急性粒细胞白血病第1次完全缓解期4例，慢性粒细胞白血病10例（慢性期7例，加速期2例，急性变1例），重型再生障碍性贫血1例。供者外周血干细胞动员采用惠尔血（日本麒麟公司）5 μg/kg皮下注射，1日2次，于第5和第6天采集干细胞。患者预处理采用单次全身照射（TBI）7 Gy＋环磷酰胺（CY）60 mg/kg×2天＋阿糖胞苷1 g/m2，12小时1次×2天方案，或者马利兰（BU）4 mg/(kg·d）×4天＋CY 60 mg/kg×2天方案。aGVHD预防采用FK506 0.03 mg/kg，或者FK506＋抗CD25单克隆抗体＋MTX联用。aGVHD 的诊断标准根据〖5］。
主要试剂
CD8-PerCP（SK2克隆）、PerCP-isotype（X40克隆）、IL-2PE（5344.111克隆）购自Becton Dickinson公司，IL-4-PE（4S.B3克隆）、IFN-γ-PE（4S. B3克隆）、PE-isotype（MouseIgG1′κ）以及CD3-FITC（SK7克隆）购自Becton Dickinson-法默金公司。溶血素（BD FACS Lysing Solution) 、破膜剂（BD FACS Permeabilizing Solution 2） 均购自Becton Dickinson公司。PMA、伊能霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)购自Sigma公司。IMDM培养基、胎牛血清等购自Gibco BRL公司。
标本采取
用肝素抗凝管分别在供者外周血干细胞动员前、动员后收集外周血1 ml。
细胞培养
肝素抗凝全血1 ml与IMDM 1∶1在培养皿中混匀，并加入佛波醇酯(10 ng/ml)和伊能霉素(500 ng/ml)、莫能霉素(1.7 μg/ml)，37℃、5％ CO2孵箱中孵育4小时。
细胞表面染色及胞内染色
将20 μl CD3-FITC和CD8-PerCP分别加入Falcon管中。将培养4小时后的稀释全血200 μl分别加入上述各Falcon管，涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。15分钟后，各管中加入2-3 ml 1×FACS溶血素混匀，室温避光孵育10分钟后500 ×g 离心5分钟，弃上清。分别加入1×破膜剂(BD Permercia 2) 500 μl涡旋混匀，室温避光孵育10分钟。完毕后加入2-3 ml洗液（含2％热灭活胎牛血清和0.1%叠氮钠的PBS），离心500×g 5分钟后弃上清。在对照管中加入PE-isotype，检测管中分别加入IL-4-PE、IFN-γ-PE，室温避光孵育30分钟。用洗液洗1遍，弃上清，以1％多聚甲醛悬浮细胞至500 μl待测。
流式细胞术检测分析
样本在FACS Calibur流式细胞仪上进行检测，应用CellQuest软件进行测定和分析。首先在前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）的点图内设门（gating），淋巴细胞群作为门1（G1），门内收集10 000淋巴细胞。以G1为基础在CD3和SSC的点图内圈定CD3+淋巴细胞群作为门2（G2）。分析G1内CD3+细胞群的细胞因子（IL-4、IFN-γ、IL-2）阳性细胞比例，并分析G2内CD3+细胞群中CD8+和CD8-细胞的细胞因子表达细胞比例，以IFN-γ阳性和IL-4阳性分别代表Ⅰ、Ⅱ型T细胞。
统计分析
应用SPSS 10.0软件进行统计学分析。检测结果以中位数（最小值-最大值）表示。动员前后比较采用配对样本t检验，组间比较采用非参数检验以及卡方检验。
结 果
供者Ⅰ型、Ⅱ型T淋巴细胞亚群细胞比例在动员前后的变化
检测20例供者动员前后T淋巴细胞亚群的INF-γ和IL-4阳性细胞比例，并进行动员前后比较。结果显示，供者INF-γ阳性CD3+、CD4+、CD8+T细胞的比例在G-CSF动员后显著升高，而IL-4阳性CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例升高不显著。检测了14例供者IL-2阳性T淋巴细胞亚群比例，各亚群的IL-2阳性细胞比例在动员后均明显升高（附表）。Table. Changes of donor′s type Ⅰ and Ⅱ ratios of T lymphocyte subpopulation cells before and after mobilization（略）
G-CSF动员对不同HLA等位基因供者的影响
11例供者表达HLA等位基因A1、A3、A24、B44、B60、DR15、DR17（阳性基因）。这些供者动员后的CD3+IFN-γ+T细胞比例为33.8% (0.3%-53.9%)，明显高于动员前的比例3.5% (0%-45.9%)（P=0.01）。未表达前述HLA等位基因（阴性基因）的9例供者动员后CD3+IFN-γ+T细胞比例〖14.0%(0%-38.6%)］与动员前比例〖2.7%(0%-28.5%)］相比无明显差异（P=0.137）（图1）。
aGVHD组和无aGVHD组的供者T淋巴细胞亚群Ⅰ、Ⅱ型细胞比例比较
去除移植后早期死亡的1例患者，有12例患者在移植后1月内发生aGVHD，与另7例无aGVHD者相比，两组供者的T淋巴细胞亚群Ⅰ、Ⅱ型细胞比例与动员前无明显差异，而动员后aGVHD组的Tc1细胞比例显著升高，Tc1在aGVHD组和无aGVHD组的比例分别为10.2% (0.3%-38.1%) vs 1.1% (0.0%-16.0%) (P=0.042)（图2）。
高Tc2细胞比例与中重度aGVHD的相关性
以上述19例供者动员后中位Tc2比例值（1.9%）为界，Tc2比例≥1.9%者有10例，＜1.9%者有9例，移植后前者仅有2例发生中重度aGVHD（20.0%），而后者有7例(77.8%)发生中重度aGVHD(P=0.019)，结果呈负相关。
讨 论
早期研究发现，G-CSF能增强效应细胞抗体依赖的细胞毒效应［6］。应用 RT-PCR方法研究发现，G-CSF动员后癌症患者外周血单个核细胞(G-PBMNC)持续高表达IL-2、4、10、IFN-γ和TNF-α［7］。近年来的研究显示，与正常人的PBMNC相比，从G-CSF动员后癌症患者PBMNC中纯化的CD4+、CD8+T细胞的IL-2、4、10和IFN-γ的mRNA水平增加［8］。本研究应用流式细胞术检测淋巴细胞内细胞因子蛋白水平表达，发现G-CSF动员后IL-2、IFN-γ阳性细胞比例显著增加，与动员前相比，动员后IL-4阳性细胞比例虽有增加但差异不显著。
G-CSF对淋巴细胞发挥作用的确切机制目前尚不清楚。早期观点认为，淋巴细胞没有G-CSF受体，因而推测可能是通过间接调节机制发挥作用。Sloand等［9］用RT-PCR方法在G-CSF刺激培养后的纯化淋巴细胞中发现G-CSF受体mRNA表达，提示G-CSF可能直接作用于淋巴细胞，但是其确切作用机制至今尚未明确阐述。另外，在Joshi等［10］的研究中，动员后供者T细胞免疫功能增强或者减弱与自身的HLA等位基因有关，携带HLA-A1、A3、A24、B44、B60、DR15、DR17等位基因的供者，动员后T细胞分泌I型细胞因子TNF-α和IL-1的能力增强。其研究与目前认为HLA相合同胞移植中HLA-A3等位基因与高aGVHD危险相关的观点部分相符［11］。本研究发现，表达前述HLA等位基因的供者在动员后IFN-γ阳性T细胞比例亦明显增加，因此G-CSF动员后细胞免疫功能增强的机制较为复杂，有待于进一步研究。
G-CSF动员后淋巴细胞免疫功能增强，但临床上并未发现外周血干细胞移植比骨髓移植有更高的aGVHD发生率。研究发现，G-CSF动员后的干细胞采集物（G-PBSC）中含有比标准骨髓采集物中高约50倍以上的单核细胞及其祖细胞［12］，动员后的单核细胞产生Ⅱ型极化，从而抑制T细胞的功能。另外，新近研究发现，G-PBSC中含有较多的低密度粒细胞（LDG），其能抑制T细胞产生IFN-γ和IL-4的功能，而去除LDG后T细胞产生细胞因子的能力又会恢复［13］。因此，G-PBSC中高比例单核细胞、LDG对T淋巴细胞功能的抑制可能是allo-PBSCT的aGVHD发生率不高于BMT的原因。
比较移植早期发生aGVHD组与无aGVHD组，aGVHD组的供者动员后Tc1（CD8+IFN-γ+）细胞比例显著升高。Tc1细胞不仅以细胞-细胞方式通过诱导穿孔素、端粒酶和Fas依赖的细胞毒作用直接导致靶细胞损伤，并通过分泌IFN-γ控制和增强对异体抗原的免疫应答、诱导CTL和NK细胞活化、预激单核巨噬细胞产生前炎症细胞因子IL-1和TNF-α，从而促进aGVHD 发生［14］。而Tc2（CD8+IL-4+）细胞可以通过“否决”CTL前体细胞方式抑制细胞免疫［15］，在动物骨髓移植模型中还发现Tc2细胞对于减轻aGVHD的严重程度有重要作用［16］。本研究发现，供者动员后高Tc2比例组的中重度aGVHD的发生率低于低Tc2比例组。
通过对G-CSF动员后供者Tc1、Tc2细胞比例的检测，有助于对aGVHD发生危险性进行预测，对于高aGVHD风险患者加强免疫抑制药物预防有指导意义。
【】
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