眼睑基底细胞癌组织中p21WAF1/CIP1基因表达的研究
作者：陈华新 张端莲 李培安
【摘要】 目的：探讨眼睑基底细胞癌组织中p21WAF1/CIP1基因的表达。方法: 收集武汉大学人民病理科1999～2006年收集的手术切除及活检的基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共40例，另取癌周围组织5例作对照。基底细胞癌发病年龄20～68岁。根据细胞分化程度,将BCC分为分化型(角化型、囊样型、腺样型)和未分化型(实体型、色素型、浅表型、硬化型) ,其中BCC分化型22例,未分化型18例。将基底细胞癌和正常组做免疫组织化学染色，观察各组细胞内p21WAF1/CIP1基因表达的变化。利用HPIAS?2000图像分析系统测定p21WAF1/CIP1基因在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：基底细胞癌组织中p21WAF1/CIP1基因呈低表达，癌旁组织中p21WAF1/CIP1基因呈高表达。图像分析结果显示，基底细胞癌组织与癌旁组织之间p21WAF1/CIP1基因的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)。结论：p21WAF1/CIP1基因在肿瘤的发生中起了重要的作用。
【关键词】 眼睑；基底细胞癌；p21WAF/CIP1基因
眼睑基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC) 是眼睑恶性肿瘤中最常见的一种，虽然其发病缓慢，恶性程度和转移性较低，但发病人数的逐年增多，已引起人们高度重视。研究显示，多种癌基因的异常表达在眼睑BCC的发生发展过程中有着重要作用。研究癌相关基因在BCC 发生、发展及转移机制中的作用，对于揭示BCC 的生物学行为与探索有效的防治方法具有重要意义。
p21WAF/CIP1基因是目前已知具有最广泛活性的细胞周期抑制基因,参与了细胞增殖、分化、衰老、凋亡以及DNA损伤修复等多种功能的调节。目前普遍认为肿瘤是一种以细胞周期失调为特征的疾病,众多研究已证实细胞周期抑制基因p21WAF/CIP1基因与肿瘤的发生发展密切相关［1，2］。
1 材料与方法
本实验采用免疫组织化学方法观察了p21WAF/CIP1基因在眼睑基底细胞癌组织中的表达,探讨p21WAF/CIP1在眼睑基底细胞癌组织中的作用机制，旨在为临床上进一步探讨眼睑基底细胞癌发生.发展的确切机制提供理论依据。
1.1 材料
1.1.1 标本来源 收集武汉大学人民医院病理科1999～2006年收集的手术切除及活检的基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共40例，另取癌组织周围正常组织5例作对照。基底细胞癌发病年龄20～68岁。根据细胞分化程度［2］ ,将BCC分为分化型(角化型、囊样型、腺样型)和未分化型(实体型、色素型、浅表型、硬化型) ,其中BCC分化型22例,未分化型18例。所有标本均经10%甲醛固定, 常规HE染色，光镜观察，病理检查确诊。
1.1.2 主要试剂 浓缩型兔抗人p21多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1.1.3 主要仪器 YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。
1.2 方法
1.2.1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。
1.2.2 免疫组织化学S?P法检测p21抗原 主要步骤：组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；p21采用微波抗原修复（3档，10 min），PBS洗4×5min；正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组织化学结果判断
p21相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对p21的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。
1.4 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 HE染色
瘤体由基底样细胞组成，细胞核大，呈圆形或椭圆形，胞浆为嗜碱性，可见少量核分裂相。瘤体周边细胞呈栅栏状排列。肿瘤周围结缔组织增生，有较多纤维母细胞，产生胶原纤维包绕在瘤体周围。光学显微镜下将BBC分为：①未分化类:包括实体型、色素型、浅表型和硬化型;②分化类:角化型、囊肿型和腺样型。实体型瘤体大小不等，边界较为清楚，周边部细胞呈栅状排列，周围结缔组织增生。硬化型可见纤维组织增生，将瘤细胞挤压成条索状。色素型瘤体内可见大量色素，周边部细胞呈栅状排列。腺样型瘤细胞排列为腺样或管状结构，或相互交织成条状。角化型可见角化不全细胞及角囊肿。
2.2 p21WAF/CIP1基因的表达
基底细胞癌组织内可见癌细胞胞浆或胞核内可见少量的棕黄色颗粒，p21WAF/CIP1基因表达较弱；癌旁组织细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，p21WAF/CIP1基因表达强。图像分析结果显示，基底细胞癌p21WAF/CIP1基因表达的平均光密度为0.0834±0.0073，癌旁组织p21WAF/CIP1基因表达的平均光密度为0.2294±0.0250；基底细胞癌p21WAF/CIP1基因表达的阳性面积率为0.1024±0.0059，癌旁组织p21WAF/CIP1基因表达的阳性面积率为0.2543±0.0271。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01﹚。经q 检验，基底细胞癌与癌旁组织之间，p21WAF/CIP1基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，见表1。
表1 基底细胞癌与癌旁组织p21WAF/CIP1基因表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 基底细胞癌与癌旁组织比较，P＜0.01。
3 讨论
眼睑基底细胞癌是中老年常见的癌症之一。通常发生于暴露日光的皮肤上, 占所有眼睑恶性上皮性肿瘤的80%～90%, 好发于下睑及内眦。BCC 是生长缓慢的肿瘤,病程较长, 一般只局部侵袭, 很少转移, 但若不及时, 肿瘤可侵及眼轮匝肌、睑板和眶骨, 并可经眼眶向颅内侵犯［3，4］。近年来随着人口的高龄化, BCC有逐渐增多的趋势。
p21WAF/CIP1基因位于人6号染色体(6p21.2),全长约11 kb,为单拷贝基因,有3个外显子和2个内含子［5］,编码的蛋白质由164个氨基酸组成,富含精氨酸,分子量为21 kD,目前将其归类于CDK抑制因子(CKI)Cip/Kip家族［6］。p21WAF/CIP1基因是肿瘤抑制基因p53的下游基因［7］，当细胞DNA受到损伤时,p53被诱导表达,p53又诱导p21WAF/CIP1基因表达,p21蛋白与周期蛋(cyclin)、CDK及增殖细胞核抗原(proliferating?cell nuclear antigen, PCNA)形成周期蛋白?CDK4/p214/PCNA四聚体复合物使细胞增值信号不能有效形成,从而使损伤的细胞阻滞于G1期,细胞有足够时间进行损伤修复［8，9］。由于p21具有重要的生物学功能,因p21WAF/CIP1基因的突变可能导致肿瘤易感性的增加。基因p21如果发生异常,则失去对细胞周期素、CDK及其复合物蛋白激酶活性的正常调节,影响细胞增殖与分化的调控,导致恶性肿瘤的发生。
本实验采用免疫组织化学方法观察了p21WAF/CIP1基因在眼睑基底细胞癌组织及癌旁组织中的表达。实验结果表明，40例眼睑基底细胞癌组织中p21WAF/CIP1基因表达水平明显低于癌旁组织,差异有显著性(P<0.01)，表明p21WAF/CIP1基因可能是通过其编码蛋白的表达水平来调节细胞周期, p21WAF/CIP1基因基因的表达量的多少与肿瘤密切相关。p21WAF/CIP1基因的低表达,可造成异常细胞增生,有益于肿瘤的形成。在癌旁组织中,p21作为细胞周期抑制因子,使细胞周期阻滞在G1期,因而推测p21也能抑制肿瘤细胞的生长,从而参与肿瘤的发生和。
p21WAF/CIP1基因在细胞周期调控中发挥着重要作用,其表达的异常化就可能导致细胞生长失控及恶性变化,因而在对肿瘤的评价与预后中,p21的表达情况有可能作为一个重要参数。
p21蛋白是目前已知具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白,通过依赖或非依赖p53途径,参与细胞生长、发育、分化、衰老及DNA损伤修复等多种功能的调节。p21WAF/CIP1基因具有高度保守性,在细胞周期调节、细胞分化和细胞凋亡具有重要作用,由于其可与多种因子在基因和蛋白水平相互作用,使其在复杂的调控中位于重要的位置,因此在肿瘤的发生发展中也具有不可忽视的作用。
【】
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