谷氨酸对大鼠纹状体神经元活动的影响

      作者：李伟红 庄晓燕 高素华 张红焦 金菊 常志杰

【摘要】  目的:研究谷氨酸（L-glutamic acid，GLU）及受体阻断剂MK-801对雄性大鼠纹状体（striatum ，STR）神经元自发放电活动的影响。方法: 应用微电泳方法记录纹状体神经元自发放电活动。结果: 微电泳GLU使84.13%STR神经元自发放电频率加快。在43个STR神经元中直接微电泳MK-801可使62.79%STR神经元自发放电频率降低。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU期间给予MK-801拮抗GLU的兴奋效应，可使 90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢。结论: GLU对STR神经元起兴奋作用， 但其兴奋作用可被MK-801所拮抗，当直接微电泳MK-801时，可使STR神经元产生抑制效应。 研究提示抗谷氨酸作用的药物有抗帕金森病（Parkinson disease，PD）的作用。

【关键词】  微电泳; 纹状体; 谷氨酸; MK-801

　　纹状体（STR）是基底神经节中的一个重要核团，由尾核、壳核和苍白球组成。尾核和壳核称为新纹状体;苍白球称为旧纹状体。本研究指的是新纹状体。它主要接受大脑皮层和皮层下的传入纤维，再发出轴突投射到苍白球和黑质［1］。这些核团间存在着复杂的纤维联系，共同参与躯体运动的调节。因此本实验采用微电泳及细胞外记录方法观察GLU和阻断剂MK-801对STR神经元自发放电活动的影响，以探讨GLU在躯体运动中的调节作用。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验动物 采用Sprague-Dawley雄性大鼠40只，体重250g±30g，由辽宁医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2实验试剂 GLU、MK-801、焦油紫均由美国Sigma公司提供，乌拉坦、多聚甲醛由沈阳化工试剂厂提供。 其它均为国产分析纯试剂。

　　1.1.3实验仪器 脑立体定位仪（西北光学仪器厂）;51217型微管拉制仪（美国STOELTING公司）;微电泳仪（中科院上海生理研究所）;SMUP生物信号处理系统（上海第一医科大学）;CM800冰冻切片机（日本Leica公司）;OLYMPUS 光学显微镜（日本产）。

　　1.2实验方法

　　1.2.1手术 以20%乌拉坦（1ml/100g）腹腔麻醉后，将大鼠置于脑立体定位仪上行常规开颅术。

　　1.2.2微电泳及细胞外记录 根据Paxions&Watson的大鼠脑图谱［2］，对纹状体（STR）定位（高度从脑表计）。坐标为前囟后-0.8～1.2mm，中线旁开2.5～3.5mm，脑表下5.0～ 6.0mm。 采用51217型微管拉制仪所拉制的3管玻璃微电极，尖端直径4～8μm，中心管（5～12MΩ）管内灌注含1%滂胺天蓝的3.0M NaCl溶液作为神经元放电活动的引导电极，外周管电阻为20～100MΩ，按需要分别灌注以下药物:GLU（1.0 mol/l，pH 8.0）、MK-801 （0.01mol/l，pH4.0）、NaCl（3 mol/l，pH7.0，对照）。借助微电极推进器将微电极缓慢插入纹状体，记录STR神经元自发放电情况。使用微电泳仪进行微电泳，电泳电流为10～150nA，电泳时间为20s，滞流电流为5～10nA，可根据实验需要及神经元情况进行适当调节。除GLU外，其余皆用正电流泳入。分别观察GLU及MK-801对STR神经元放电活动的影响。再在微电泳GLU期间，给予MK-801，观察对STR神经元放电的影响。为了排除可能发生的电流作用，只要注入NaCl引起任何放电变化，该资料则不列入统计。神经元放电活动由微电极引导信号，经放大器放大、滤波、显示于示波器上，并输入SMUP生物信号处理系统，计数神经元放电情况，结果自动制成序列密度直方图。

　　1.2.3组织学定位 实验结束后，经中心管给予20μA阴极直流电，经微电极电泳滂胺天蓝到记录部位，通电10～15min。对麻醉后实验动物开胸，经升主动脉首先用100ml生理盐水（37°C）快速冲洗血管后，继而用含4%多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液500ml灌流固定。开颅取出完整脑组织，做成长度为 1.5cm 的组织块，放入含4%多聚甲醛的磷酸固定液中固定（4° C，3h）;再将组织块移入含20%～30%蔗糖磷酸缓冲液中（pH=7.4，4°C），浸至其沉底。24h后，置于0.1M磷酸缓冲液中脱糖（3次，每次10min），后置于连续冰冻切片机内，-20°C， 做连续冠状切片，切片厚30μm。焦油紫染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下进行组织学鉴定并拍照。

　　1.2.4数据处理 分别记录微电泳前后神经元放电频率，同时还记录微电泳后神经元兴奋或抑制的持续时间。微电泳药物后放电频率变化=（电泳药物期间放电频率-电泳前20s放电频率）/电泳前20s放电频率×100%。微电泳药物后放电变化超过±30%为有效临界值，进行统计分析。统计资料以均数±标准差（ x±s）表示，进行t检验，比较显著性差异。以P<0.05为差异显著性指标，P <0.01为差异极显著性指标。

　　2实验结果

　　共观察了63个STR神经元。其中 84.13%STR神经元在微电泳GLU（20～80nA，20s）之后自发放电频率加快，平均放电频率由微电泳前的1.74±0.94Hz增加到3.31± 1.63Hz，给药前后放电频率差异显著（ P <0.01）。GLU对STR神经元放电影响特点是作用明显、迅速，无潜伏期，无明显后作用，停止微电泳GLU后，放电迅速恢复到基础水平。另有11.11%STR神经元对GLU无反应，4.76%STR神经元微电泳GLU后表现为抑制作用。在43个STR神经元中直接微电泳受体阻断剂MK-801（40nA，20s），可使62.79%STR神经元自发放电频率降低，平均放电频率由微电泳前的2.18± 1.18Hz 降低到1.53±1.20Hz，给药前后差异极显著（ P < 0.01）。 MK-801作用特点是作用缓慢而持久，有潜伏期（7.02±6.60s），且有明显的后作用，平均后作用时间为37.76± 9.01s， 电泳MK-801停止后需较长时间的后抑制，放电才逐渐恢复至基础水平。另使4.65%STR神经元放电频率加快，32.56%无明显变化。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU（40nA，60s）期间给予MK-801（40nA，20s）拮抗GLU的兴奋效应，可使 90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢，平均放电频率由微电泳MK-801前的3.22±1.41Hz减少到1.49±0.83Hz，给药前后具有极显著性差异（ P <0.01）。另有9.09%已产生兴奋效应的STR神经元对MK-801无反应。见表1，图1。

　　图1 GLU及MK-801对STR神经元放电的影响（略）

　　表1 GLU及MK-801对STR神经元放电的影响（略）

　　3讨论

　　目前研究结果表明，基底神经节与大脑皮层之间的回路主要有两条［3］:一为直接通路，二为间接通路。直接通路是从皮层广泛区域→新纹状体→苍白球内侧部→丘脑前腹核和外侧腹核（VA-VL）→皮层运动前区的神经通路;间接通路是指皮层广泛区域→新纹状体→苍白球外侧部→丘脑底核→苍白球内侧部→丘脑前腹核和外侧腹核（VA-VL）→皮层运动前区的神经通路。纹状体主要接受来自大脑皮层的GLU能纤维、苍白球外侧部的γ-氨基丁酸能纤维及黑质的多巴胺能纤维。在随意运动的控制中，两条通路的平衡非常重要。本实验观察到微电泳GLU使84.13%STR神经元放电频率加快，平均放电频率由微电泳前的1.74±0.94Hz增加到3.31± 1.63Hz， 给药前后放电频率差异显著（ P <0.01）。从图1可见GLU对STR神经元放电影响特点是作用明显、迅速，无潜伏期，无明显后作用，停止微电泳GLU后，放电迅速恢复到基础水平。此结果表明GLU对STR神经元起兴奋作用。GLU受体有两类:一类为离子型GLU受体，GLU是通过激活了配体门控阴离子通道而发挥作用;另一类为代谢型GLU受体，是通过与G蛋白耦联来调节兴奋型突触的活动和神经元的兴奋性［4］。在43个STR神经元中直接微电泳MK-801（40nA，20s），可使62.79%（27/43）STR神经元自发放电频率降低，平均放电频率由微电泳前的2.18±1.18Hz降低到1.53± 1.20Hz， 给药前后差异极显著（ P <0.01）。MK-801作用特点是作用缓慢而持久，有潜伏期（7.02±6.60s），且有明显的后 作用，平均后作用时间为37.76±9.01s，电泳MK-801停止后需较长时间的后抑制，放电才逐渐恢复至基础水平。此结果表明直接微电泳MK-801时，可使STR神经元产生抑制效应。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU（40nA，60s）期间给予MK-801（40nA，20s）拮抗GLU的兴奋效应，可使 90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢，平均放电频率由微电泳MK-801前的3.22±1.41Hz减少到1.49±0.83Hz，给药前后具有显著性差异（ P <0.01）。此结果表明在基底神经节环路中，主要来自大脑皮层的GLU能对STR神经元施加兴奋作用，但其兴奋作用可被非选择性 NMDA受体阻断剂MK-801所拮抗，进一步表明调节该兴奋作用的受体至少有NMDA受体的参与，提示STR神经元存在NMDA受体［5］。MK-801属于开放通道阻滞剂，作用于对膜电场敏感的NMDA受体-通道内部。由于纹状体是引起帕金森病的主要核团，而GLU对PD的产生起重要的介导作用。新近研究表明L-GLU与PD发病有关，提示抗谷氨酸作用的药物有抗PD作用。

【】
  　　1 徐科，等.神经生物学纲要. 北京:出版社，2000，202～207.

　　2 Paxion G，Waston C.The rat brain in stereotaxic coordinates Aca-demicpress，1982，New York .

　　3 姚泰，主编. 生.第6版.北京:人民卫生出版社，2003，312～313.

　　4 李金莲，等. 代谢型谷氨酸受体7亚型在大鼠中枢神经系统内的分布.解剖学报，1999，30（1）:1～6.

　　5 Youssef. F，Stone.TW，Addae.JI，et al. Interactions of glutamate receptor qgonists with long-term potentiation in the rat hippocam-pal slice. Eur JPharmacol，2000，23（3）:349～359.