原位杂交检测cyclinE在皮肤血管瘤组织中的表达

【摘要】  目的: 探讨细胞周期素E（cyclin E）在皮肤血管瘤组织中的表达及临床意义。方法: 采用原位杂交方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclinEmRNA表达水平， 利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度。结果: 增生期血管瘤内皮细胞cyclin EmRNA表达水平明显高于退化期及正常皮肤组织，差异有显著性意义（ P <0.01）;退化期与正常皮肤组织血管内皮细胞cyclinEmRNA表达水平差异无显著性意义（ P >0.05）。结论: 细胞周期素E在血管瘤的发生中起了重要的作用。

【关键词】  原位杂交; 血管瘤; 细胞周期素E; 阳性面积率; 平均光密度

 　　血管瘤是婴幼儿中发病率最高的一种以内皮细胞异常增殖为组织学特征的肿瘤。新生儿患病率为1.1%～3.8%，至1岁时可高达10%。目前成人病例也呈逐渐上升趋势。虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持续或其生长部位特殊而具有一定的危险性，如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，如持续发展可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症。临床尤其对于大面积血管瘤的治疗尚缺乏确切、迅速有效的方法。虽然血管瘤各期的组织形态学特征已经通过免疫组织化学方法鉴定出来，但其发病机制尚不清楚，因此，也难以寻找到一种有效的治疗手段。细胞周期素E （cyclin E）是细胞周期重要的调节因子，cyclinE与特定的细胞周期依赖性激酶（cyclin depen-dentkinases，CDKs）构成复合体，可以使底物磷酸化，启动DNA 的合成， CDK 抑制蛋白（ cyclin-dependent kinase inhibi-tor proteins ，CKIs） 能够抑制cyclinE的活性。不同的物质可以通过与CKIs之间直接或间接的相互作用影响cyclinE的表达，这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的，而且可以为大量常见的肿瘤提供预后的信息。我们采用原位杂交方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的cyclinEmRNA表达水平， 并利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度，探讨细胞周期调节因子cyclinE在血管瘤发生中的作用。

　　1材料

　　1.1材料来源收集武汉大学人民病理科2002～ 2005 年皮肤血管瘤存档蜡块50 例， 其中男性26例，女性24例， 年龄2月～18岁。血管瘤位于头皮、眼睑、耳部、颈部、胸部、上臂、手部及大腿等部位。患者术前均未做任何辅助性治疗。

　　1.2材料分组蜡块切片厚5um，常规HE染色和原位杂交方法检测血管瘤组织中cyclinEmRNA的表达。按Mulliken分类标准将切片分组， 其中增生期血管瘤24例， 退化期血管瘤26例。另取瘤组织周围正常皮肤5例作为对照。
　　
　　2实验方法

　　2.1常规HE染色

　　2.2原位杂交①常规脱蜡至水。用3%H2 O2 室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶。②用2滴细胞打孔液将组织切片浸泡10～40min，0.1M PBS室温5min洗3次，用无RNA酶 处理过的滤纸吸干。③暴露mRNA核酸片段:切片上滴1滴复合消化液，37℃消化5～20min。④0.5M PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次，用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑤预杂交:干的杂交盒底部，加5～10ml蒸馏水。每张切片加20ul（或1滴）预杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，置于4℃杂交过夜。用2×SSC洗涤5min×3次，用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑥杂交:干的杂交盒底部，加5～10ml蒸馏水。每张切片加10～20ul（或1滴）含寡核苷酸探针的原位杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱37℃ 杂交4～5h。⑦杂交后洗涤:揭掉盖玻片，30～37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×3 次。用无RNA酶处理过的滤纸吸干。⑧滴加 SA-HRP:37℃20min或20℃左右30min。0.5MPBS洗5min×4次，用无RNA酶 处理过的滤纸吸干。⑨DAB显色:滴加1滴预先配制混匀的DAB显色试剂至标本上，显色5～15分钟。⑩酒精脱水，二甲苯透明，封片。

　　2.3图像分析处理将血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织的切片置O-LYMPUS显微镜下（400×），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入HPIAS-1000多媒体彩色病理图像分析系统（同济千屏影像公司）进行处理，每例随机选取5个完整而不重叠的视野进行定量分析，测定免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度和面积的百分率，取每张切片的均值作为该例的测量值。

　　2.4统计学方法用SPSS11.5 统计软件对3组样本阳性颗粒的平均光密度和阳性面积率做单因素方差分析和SNK （q） 检验， 检验水准α 为0.05。

　　3结果

　　3.1HE染色增生期血管瘤组织中可见大量增生活跃的内皮细胞， 内皮细胞核肥大而淡染。退化期血管瘤组织中血管内皮细胞明显减少， 形成大量的毛细血管腔， 血管间结缔组织增多， 内皮细胞核扁平。

　　3.2原位杂交增生期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆有较密集蓝色颗粒;退化期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆蓝色颗粒不明显;正常皮肤组织血管内皮细胞胞膜和胞浆无蓝色颗粒沉积。经单因素方差分析， 3组样本cyclinEmRNA的表达差异有显著性意义（ P <0.05）。经SNK（ q ）检验， 增生期组与退化期组、增生期组与正常皮肤组的阳性面积率和平均光密度的差异有显著性意义（ P <0.01）;退化期组与正常皮肤组上述两指标的差异无显著性意义（ P >0.05）。

　　表1 原位杂交检测血管瘤不同时期cyclinEmRNA表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注:# 增生期组与退化期组比较， P<0.01;* 增生期组与正常皮肤组比较， P <0.01。

　　4讨论

　　血管瘤的病程包括增生期、退化期和退化完成期3个阶段。目前血管瘤的发病机制还不完全清楚［1］，血管瘤内皮细胞的过度增殖无疑是血管瘤增殖期最具特征性的变化，同时也是血管瘤发生、的基础。Mulliken［2］根据其内皮细胞的行为特点将其分为增生期和退化期。增生期血管瘤表现为肥大、功能活跃的内皮细胞增生，基底膜增厚、呈多层，形成含有毛细血管大小的管腔或无腔的肿块，内皮细胞DNA合成增强，取此时期的内皮细胞进行体外培养可形成毛细血管样结构。退化期血管瘤表现为内皮细胞数目减少，血管腔增大，血管间有结缔组织和脂肪细胞浸润，此期内皮细胞DNA合成不活跃，体外培养难以形成毛细血管样结构。细胞周期素E （cyclin E） 是细胞周期重要的调节因子，cyclin E与特定的细胞周期依赖性激酶（ cyclin dependentki- nases ，CDKs） 构成复合体，可以使底物磷酸化，启动DNA的合成， CDK抑制蛋白（ cyclin-dependent kinase inhibitorpro-teins，CKIs） 能够抑制cyclin E的活性。不同的物质可以通过与CKIs之间直接或间接的相互作用影响cyclinE的表达，这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的［3］，而且可以为大量常见的肿瘤提供预后的信息。Cyclin E在众多人类肿瘤中异常表达。在大多数肿瘤的研究中，用免疫标记的方法确认cyclin E在核内表达，但胞浆染色被观察到的越来越多，其意义仍不清楚。虽然cyclin E蛋白在胞浆内合成和降解，通常情况下快速转运至核内发挥作用，cyclin E在胞浆内的聚集可能反映了合成增加、降解减少或核转运障碍［6］。我们过去用免疫组织化学的方法检测了不同时期的血管瘤和正常皮肤血管组织中cyclinE的表达，结果证明增生期血管瘤cyclinE表达水平高于退化期，差异有显著性（ P <0.01），增生期血管瘤cyclinE表达水平高于正常皮肤组织（ P <0.05），说明cyclinE的高表达与血管瘤的发生有关。我们此次采用原位杂交的方法检测了同一批标本，利用含生物素标记寡核苷酸探针的原位杂交具有特异性强、敏感性高、定位精确、定量可靠的优点，可完整的保持组织细胞的形态结构，能准确地反映组织细胞的相互关系及功能代谢状态的特点，探讨cyclinE与血管瘤病程的关系。结果与免疫组织化学相同， 增生期血管瘤cyclinEmRNA表达水平高于退化期（ P <0.01），增生期血管瘤cyclinEmRNA表达水平高于正常皮肤组织（ P < 0.05）， 差异有显著性。并且证明cyclinEmRNA于血管瘤增生早期就开始表达，至血管瘤增生期cyclinEmRNA的表达达到高峰。可见cyclinE和cyclinEmRNA的表达与血管瘤的增生是一致的，这说明cyclinE的表达在血管瘤增生期组织中增加具有性，cyclinE是随着血管瘤的增生不断表达增加的。实验证明高表达cyclinE的为内皮细胞。血管瘤内皮细胞的过度增殖无疑是血管瘤增殖期最具特征性的变化，同时也是血管瘤发生、发展的基础。

【】
  　　1 Sso ian PK. A ncho rage2dependent Cell Cycle P rogression. The Journal of Cell Biology， 1997， 136 （1） : 1～ 4.

　　2 M uliken JB， Glowack J. Hemangiomas and vascular malforma-tions in infants and ch ildren: a classification based on endothelial characteristics. Plast Reconstr Surg， 1982， 69 （ 3） :412～ 422.

　　3 Xiangming C ，Natsugoe S. Takao S ，et al. The cooperative role of p27with cyclin E in the prognosis of advanced gastric carcinoma1Cancer，2000，89（6）:1214.

　　4 Mishina T ，Dosaka- Akita H ，Hommura F ，et al. Cyclin E expres-sion ，a potential prognostic marker for non-small cell lung canc-ers.Clin Cancer Res，2000，6（1）:11.

　　5 Muller-Tidow C ，Melzger R ， Kugler K， et al. Cyclin E is the onlycyclin-dependent kinase2-associated cyclin that predicts metas-tasis and survival in early stage non-small cell lung cancer.Cancer Res ，2001，61 （2） :647.

　　6 Donnellan R ，Kleinschmidt I ，Chetty R.Cyclin E immunoexpres-sion in breast ductal cancinoma : pathologic correlations and prog-nostic implications.Hum Pathol，2001，32 （1）:89.