乌司他丁对急性肺损伤组织中水通道蛋白表达的研究
作者：郭亮 张端莲 吴惠芬 蔡丽华
【摘要】 目的:探讨乌司他丁对急性肺损伤组织中水通道蛋白-1、4（Aquaporin，AQP-1、4）的表达及临床意义。方法: 应用脂多糖（LPS）诱导大鼠急性肺损伤（ALI）模型，然后应用乌司他丁进行干预。实验设对照组、模型组、乌司他丁组，采用免疫组化染色， 检测乌司他丁（ulinastatin，UTI） 对急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白-1、4（AQP-1、5）的表达， 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1、4在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果: 实验对照组肺组织表达高水平AQP-1、4;模型组肺组织呈浅黄色染色， AQP-1、4表达较低;乌司他丁组肺组织表达高水平AQP-1、4。经 q 检验，实验对照组与模型组之间，AQP-1、4的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（ P <0.01）;实验对照组与乌司他丁组之间，AQP-1、4的平均光密度及阳性面积率差异无显著性（ P >0.05）。结论:乌司他丁能使急性肺损伤组织中AQP-1、4呈高表达，对急性肺损伤组织有重要的保护作用。
【关键词】 乌司他丁; 急性肺损伤; 水通道蛋白-1、4 ; 大鼠
急性肺损伤（ALI）是以通透性肺水肿为特征的一种临床综合征，其严重阶段即急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。虽然对其发病机制已进行了大量的研究［1］，发现多种炎性介质和多种细胞参与发病，但发病机制仍不十分清楚，因此给临床带来诸多问题。乌司他丁是从男性尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂，为糖蛋白，乌司他丁分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用，除对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，还能抑制心肌抑制因子产生，改善休克时的循环状态，对溶酶体膜有稳定作用，有抑制炎症介质的释放等功能［2］。并且有实验报道［3］，乌司他丁在减轻肺损伤、缓解成人呼吸窘迫症病人呼衰等方面都起着重要作用。急性肺损伤（acute lung injury，ALI）时中性粒细胞在肺内聚集以及血管内皮细胞的功能受损，释放多种炎症介质及氧自由基、蛋白酶。近来，有许多报道［4］，乌司他丁为一种高效广谱的水解酶抑制剂，能抑制炎症介质的产生及氧自由基的释放，在临床上已广泛应用于DIC、休克、急性胰腺炎等炎性疾病的治疗，但有关乌司他丁对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖（LPS）诱导大鼠急性肺损伤（ALI）模型，然后应用乌司他丁进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白（AQP）的表达， 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率，进一步探讨乌司他丁在治疗急性肺损伤中的作用机制。
1材料和方法
1.1动物模型制备及分组 健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）， 清洁级。平均体重（180±35）g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h， 自由饮水。实验分组分为3组:实验设对照组（注射等量生理盐水， n =20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg， n =20）及乌司他丁组（于注射LPS前1h，腹腔注射乌司他丁100 000 U/kg， n =20）。称重后， 7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射麻醉， 仰卧固定， 模型组消毒后经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，乌司他丁组于注射LPS前1h，腹腔注射乌司他丁100 000 U/kg。
1.2动物标本制备将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作，取材时间为LPS注射后4h（T4）。主要试剂 :① 浓缩型兔抗鼠AQP1及AQP4多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）;② 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）;③ 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。主要仪器: YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产;家用高压锅。
1.3方法
1.3.1常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。
1.3.2免疫组织化学S-P法检测AQP1及AQP5相关抗原主要步骤如下:① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ AQP1及AQP4采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤ 一抗（AQP1，1:100;AQP4，1:100）37℃孵育1 h，PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4免疫组织化学结果判断 AQP1及AQP4相关抗原以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对AQP1及AQP4的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定AQP1及AQP5每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%）。
1.5统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK- q检验，检验水准α 为 0.05。
2结果
2.1HE染色对照组:肺组织小叶结构清晰，肺泡腔干净，肺泡间质无 炎性细胞浸润，纤维结缔组织无增生，肺泡壁无增厚，肺泡I型和II型细胞结构清晰。模型组:可见肺组织充血明显，肺泡间质有炎性浸润，肺泡壁增宽，肺泡腔内可见出血和渗出，肺泡I型和II型细胞结构不清晰。乌司他丁组:UTI干预后肺组织病理改变明显减轻。肺组织结构由结构病变严重逐渐转变为基本正常，肺泡间质只有少量的炎性细胞，肺泡I型和II型细胞结构较清晰。
2.2免疫组化结果AQP1和AQP5的表达 对照组:肺组织中AQP1和AQP4呈高表达，可见肺组织呈棕黄色颗粒，主要表达在肺血管内皮。模型组:肺组织AQP1和AQP4呈低表达，可见肺组织内有少量的棕黄色颗粒。乌司他丁组:肺组织中AQP1和AQP4呈高表达，可见肺组织呈棕黄色颗粒。图像分析结果显示:对照组AQP1蛋白表达的平均光密度为0.1637± 0.0409 ，AQP4蛋白表达的平均光密度为0.1641±0.0409;模型组AQP1蛋白表达的平均光密度为0.0586±0.0380， AQP4蛋白表达的平均光密度为0.0583±0.0381;乌司他丁组AQP1蛋白表达的平均光密度为0.1503±0.0351， AQP4蛋白表达的平均光密度为0.1524±0.0348。对照组AQP1蛋白表达的阳性面积率为0.2726±0.0514，AQP4蛋白表达的阳性面积率为0.2643±0.0516;模型组AQP1蛋白表达的阳性面积率为0.0863±0.0404，AQP4蛋白表达的阳性面积率为0.0865±0.0413;乌司他丁组AQP1蛋白表达的阳性面积率为0.2561±0.0332， AQP4蛋白表达的阳性面积率为 0.2566 ±0.0329。经单因素方差分析，组间有显著性差异（ P<0.01）。经q 检验，对照组与模型组，模型组与乌司他丁组之间，AQP1和AQP4的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（ P <0.01）;对照组与乌司他丁组之间，AQP1和AQP4的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性 （P >0.05） 。见 表1。
表1 对照组、模型组及乌司他丁组AQP1和AQP4表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注:* 对照组与模型组比较， P<0.01;☆ 模型组与乌司他丁组比较， P<0.01;☆☆ 乌司他丁组与对照组比较， P >0.05。
3讨论
急性肺损伤（Acute lung injury， ALI） 是临床常见危急重症，晚期常并发多脏器功能障碍综合症（MODS），由于缺乏有效的方法，已成为重症监护室（ICU）中死亡的主要原因之一。ALI病因各不相同，发病机制复杂。 ALI是严重感染、创伤、休克等导致的以肺泡毛细血管膜损伤为基础，渗透性肺水肿和微肺不张为特征，临床表现为急性呼吸窘迫和顽固性低氧血症的综合征。LPS是内毒素的主要成分，存在于革兰氏阴性细菌的胞壁外膜，是介导全身炎症反应的重要物质，它不仅可通过刺激炎症效应细胞（单核/巨噬细胞、多形核白细胞、内皮细胞、血小板等）产生炎症介质和细胞因子，还可直接损伤靶细胞。
水通道蛋白（Aquaporin，AQPs）是一组糖蛋白，分子量约30000 左右，属古老的跨膜通道蛋白MIP（majorintrinsic pro-tein） 家族成员，选择性地分布在那些与体液吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同液体跨细胞转运的内皮细胞中，执行着各部位的水分重吸收、液体分泌和细胞内外水平衡功能［5］。到目前为止已克隆的哺乳动物水通道蛋白家族有11个成员（AQP0～AQP10）， 肺组织中的AQP有6种，即AQP1、3、4、5、8和9［6］，其中AQP1及AQP4表达最多。上世纪90年代以后的大量研究证实，细胞代谢过程中所需要的水主要是通过AQPs对水分子的高度选择性来完成跨膜转运的。不同的细胞和组织内AQPs参与在生理和病理条件下细胞内外水的即刻分布［7］。由于水转运发生的细胞体积变化而引起的质膜扩展或收缩，可激活质膜上的机械性门控离子通道或机械性受体，继而激活某些信号的传导［8］，调整细胞的液体转运。有报道［9］，细胞死亡时最早的事件是细胞内水经水通道的外溢，推测AQPs的功能与细胞凋亡有密切关系。因此，AQPs表达或功能的改变不仅对水分子的传输产生明显影响，而且对细胞的生命活动也至关重要。AQP1是第一个发现的水通道蛋白，几乎在全身各处都有分布。毛细血管内皮是毛细血管间水转运的主要障碍，Verkman［10］研究发现如小鼠肺毛细血管内皮缺乏AQP1 ，肺泡毛细血管间水的渗透力可下降90% ，证实呼吸道中水通过毛细血管运输主要由AQP1介导。AQP4和AQP1均具有高度选择性水通透性，即除水之外不转运其他小分子溶质，但AQP4 是一种汞不敏感性水通道蛋白。有文献报道［11］，AQP1敲除小鼠肺泡毛细血管间水的渗透性较野生型降低10倍，去除AQP4的小鼠与野生型比较，肺泡毛细血管水通透性并无明显区别，但在AQP1缺失的小鼠再去除AQP4 ，肺泡毛细血管间水通透性下降14～16倍［12］。以上结果充分说明尽管AQP1及AQP4 都具有水转运功能，但其分布位置及在局部微环境中所起的作用是不同的。一个部位有多种AQPs分布，可以保证细胞以很少的能量从周围吸收水分，维持细胞正常的代谢以及复制和生存需要。本研究采用免疫组织化学显示AQP1和AQP4在对照组肺组织中呈高表达， 模型组肺组织AQP1和AQP4呈低表达， 乌司他丁组肺组织中AQP1和AQP4呈高表达。实验结果表明:对照组AQP1和AQP4呈高表达说明，证实AQP1和AQP4可以使水快速通过毛细血管内皮细胞进入周围的组织液中，调控细胞间液体量和血管容积的流体静压与胶体膨胀压，满足肺上皮细胞代谢需要，对维持肺的正常生理功能具有重要作用;模型组肺组织AQP1和AQP4呈低表达， 由此推 测ALI病理过程中，AQP1、4表达下调，肺泡毛细血管间水转运障碍，导致液体在肺泡腔、肺间质的积聚，从而使肺泡腔、肺间质水肿加重，可能参与了肺水肿时液体的异常转运。结果提示肺损伤后AQP1、4在调节肺内液体平衡中起一定作用，可能参与了ALI肺水肿的发病机制。乌司他丁组肺组织中AQP1和AQP4呈高表达，结果提示乌司他丁可能抑制炎症介质的过度释放，改善微循环、组织灌注等，通过调控SIRS/ CARS 的失衡来维持细胞内外水平衡，达到保护受损肺组织，对ALI患者肺及肺外器官功能起到重要保护作用。
【文献】
1 Steer ML . Relationship between pancreatitis and lung diseases.Respir Physiol ， 2001， 128 （1） : 131.
2 陈晓星，等.乌司他丁治疗急性胰腺炎的临床.中华肝胆外科杂志，2002，8（3）:186.
2 李劲松，等.乌司他丁抗手术侵袭临床观察报告. 临床外科杂志，2000，8（4） :228～229.
3 李立，等.腹部大手术后运用乌司他丁减少手术侵袭的临床观察.中华肝胆外科杂志，2001，7（5） :315～316.
4 贾辉，等.乌司他丁在体外循环心脏手术中的应用. 医学，2002，30（3）:2071.
5 关桂梅，董震，吕梅. 鼻息肉组织嗜酸粒细胞中水通道蛋白2和抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达及意义. 中华耳鼻咽喉科杂志，2004，39 （10） :476～478.
6 李志海，高起学. 水通道蛋白2 、5 在人鼻息肉组织中的表达. 临床耳鼻咽喉科杂志， 2005，19 （4） :162～164.
7 Agre P ，Kozono D. Aquaporin water channels : molecular mecha-nisms for human diseases. FEBS Lett ， 2003，555 :72～78.
8 Lee M D ， King L S ， Nielsen S ， et al. Genomic organization and developmental expression of aquaporin in lung. Chest ，1997 ，111 :111S～113S.
9 King L S ， Yasui M ， Agre P. Aquaporins in health and disease. Mol Med Today ， 2000 ，6 :60～65.
10 Verkman A S ， Yang B ， Song Y， et al. Role of water channels in fluid transport studied by phenotype analysis of aquaporin knock-out mice. Exp Physiol ，2000， 85 :233～241.
11 Acher R. Water homeostasis in the living : molecular organization ， osmoregulatory reflexes and evolution.Ann Endocrinol ，2002，63 :197～218.
12 Jablonski E M ， Webb A N ， McConnell N A ， et al. Plasma membrane aquaporin activity can affect the rate of apoptosis but is inhibited after apoptotic volume decrease. Am J Physiol Cell Physi-ol，2004，286: 975～985.
