骨髓增生异常综合征患者血管新生相关因子血清水平研究

【摘要】  　　为了研究骨髓增生异常综合征（MDS）患者血清血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的水平，应用酶联免疫吸附（ELISA）实验检测43例MDS患者的血清。结果表明，MDS患者VEGF、bFGF血清水平均明显高于正常对照，RAEB、RAEBT组均明显高于RA、RAS组，RAEBT组与急性髓细胞白血病（AML）组VEGF、bFGF水平无显著差别。VEGF、bFGF水平与患者的外周血细胞受累、骨髓原始细胞比例有关，VEGF与bFGF正相关（r＝0.539，P＜0.01）。结论：MDS患者VEGF、bFGF增多，其水平与MDS类型及预后有关。

【关键词】  骨髓增生异常综合征　血管内皮生长因子　碱性成纤维细胞生长因子

　　Serum Level of Angiogenesis?related Cytokins in Patients with Myelo? dysplastic Syndrome

       Abstract    To study the serum levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in patients with myelodysplastic syndrome (MDS), serum from 43 MDS patients was examined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that serum levels of  VEGF, bFGF in MDS patients were significantly elevated compared with normal control.  Serum levels of VEGF and bFGF in RAEB patients   and RAEBT patients  were higher than that in RA patients  and RAS patients （P＜0.05).  No significant difference of serum levels of  VEGF and bFGF  was found between RAEBT patients and acute myeloid leukemia (AML) patients. The serum levels of VEGF  and bFGF were correlated with the affected  peripheral  blood cells  and the proportion of blast cells in bone marrow. There was positive correlation between serum VEGF  and bFGF levels. It is concluded that the secretion of VEGF and bFGF in MDS patients is elevated and the serum  levels  of VEGF and bFGF are related to the classification and prognosis in MDS.

    Key words    myelodysplastic syndrome; vascular endothelial growth factor; basic fibroblast growth factor

    近年来研究表明, 血管新生及其调控因子在血液系统恶性肿瘤的发生中起重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是目前所知的最重要的血管新生正调控因子，可以反映骨髓微血管增生的程度，在多种恶性血液疾病中表达增高。关于骨髓增生异常综合征（MDS）患者VEGF、bFGF表达的研究，目前国内罕见有报道。为此，我们检测了43例MDS患者的血清VEGF 和bFGF水平，现报道如下。

    材料和方法

    研究对象

    43例MDS患者均为青岛大学医学院附属血液内科2004年8月份至2005年8月份门诊或住院的初诊病人，其中男性23 例，女性20 例，年龄23-76岁，中位年龄52岁。43例MDS患者中RA 16例，RAS 6例，RAEB 14例，RAEBT 7例。15例健康体检者为正常对照，15例初诊AML患者为疾病对照。

    标本采集

    清晨空腹采取静脉血4 ml，置于普通玻璃试管中，半小时内以894×g离心10分钟，分离血清，分装后于-70℃保存。

    主要试剂

    人VEGF ELISA试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产，人bFGF ELISA 试剂盒由美国Rapidbio公司生产。

    检测方法

    采用ELISA方法检测每份血清标本待测因子的水平，实验过程严格按照试剂盒提供的操作方法进行。

    统计学处理

    实验数据采用SPSS 11.5统计软件，多个均数的比较用单因素方差分析，两个均数的比较用t检验，相关性分析用Pearson相关分析。

    实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(3)骨髓增生异常综合征患者血清血管新生相关因子的研究结    果

    MDS患者血清VEGF、bFGF水平

    MDS患者的血清VEGF浓度明显高于正常对照组（P＜0.01），低于AML组（P＜0.01），血清bFGF浓度明显高于正常对照组（P＜0.01），但与AML组相比，差异无显著性（P＞0.05）（表1）。

    MDS各亚型患者血清VEGF水平

    RA和RAS组的VEGF水平与正常对照组无明显差异，RAEB和RAEBT组VEGF水平均明显高于正常对照、RA和RAS组（P＜0.05），RA与RAS、RAEB与RAEBT组间VEGF水平无显著性差异（P＞0.05）， RAEBT组与AML组差别无显著性意义（P＞0.05）（表2）。

     MDS各亚型患者血清bFGF水平

    RA、RAEB、RAEBT组血清bFGF水平均明显高于正常对照组（P＜0.05），RAEB、RAEBT组血清bFGF水平均明显高于RA和RAS组（P＜0.05），RAEB、RAEBT与AML组两两之间差别无显著性意义（P＞0.05）（表3）。

     MDS患者血清 VEGF、bFGF水平与外周血细胞系受累的关系

    外周血2系和3系受累的患者血清bFGF水平均明显高于1系受累者（P＜0.05），3系受累的患者VEGF水平明显高于1系受累者(P＜0.005)，2系和3系受累的患者VEGF和bFGF水平均无明显差别（P＞0.05）（表4）。

    MDS患者血清VEGF、bFGF水平与骨髓原始细胞比例的关系

    根据骨髓原始细胞比例将MDS患者分为4组，原始细胞比例＜5％组的患者血清VEGF、bFGF水平均明显低于其他各组（P＜0.05），原始细胞比例＞5％的各组VEGF、bFGF水平没有明显差别（P＞0.05）（表5）。Table 5. Relationship between serum levels of VEGF and  bFGF,  and blast cell proportion  in bone marrow（±SD）

     MDS患者血清VEGF、bFGF的相关性

    进一步对MDS患者血清VEGF、bFGF水平进行相关性分析，结果显示两者具有显著相关性（r=0.539，P＜0.05）。

    讨    论

    血管新生是指在原有血管的基础上形成新的血管的过程。这一过程受正、负调控因子的严密调节。以往对血管新生的研究主要侧重于实体瘤。近年来的研究发现，血液系统的恶性肿瘤也与血管新生有关，也存在血管新生调控因子的异常表达［1］。VEGF和bFGF是目前所知的作用最强、特异性最高的血管新生正调控因子，在肿瘤组织的血管形成过程中起重要作用，且两者在新血管发生过程中有协同作用，可以作为血管新生的标志物，反映骨髓血管新生的程度。

    骨髓增生异常综合征是一组异质性造血干细胞恶性克隆性疾病，以骨髓无效造血、外周血细胞减少及病态造血为特征。其发病机制非常复杂，包括干细胞损伤、增殖分化异常、过度凋亡、造血微环境改变及免疫缺陷等。MDS患者VEGF、bFGF的表达是否异于正常，国外学者的报道不一致［2-5］，我们的研究发现，MDS患者的血清VEGF、bFGF水平均明显高于正常，反映血管新生在MDS患者的发病过程中可能起一定作用。Aguayo等［1］提出，促血管新生因子可能对血液肿瘤细胞和骨髓中微血管密度起直接作用，在骨髓微血管密度增高的同时伴有促血管新生因子的明显升高，但各种因子在不同疾病中的表达水平是不同的，或增高或正常，联合2种或2种以上的促血管新生因子水平或许能更准确的反映骨髓微血管增生情况。我们的实验结果发现，MDS患者的血清VEGF、bFGF水平均较正常对照组明显升高，这更加能够反映MDS患者骨髓微血管新生情况，有力提示血管新生可能在MDS的发病过程中起重要作用。Seghezzi等［6］通过小鼠实验发现，尽管静息的内皮细胞不表达VEGF，但加入外源性重组人bFGF能引起内皮细胞合成VEGF及角膜血管形成，VEGF抗体则能抑制此作用，因此认为bFGF能够促进VEGF的表达及分泌。我们的研究发现VEGF、bFGF两者之间存在正相关关系，提示VEGF和bFGF之间可能存在相互调节作用。它们在参与MDS患者血管新生过程中的具体作用机制及相互之间的作用关系尚有待于更进一步的研究。

    MDS是一组渐进性疾病，随着其病程的，骨髓中原始细胞的比例逐渐增高，最终可以演变成为白血病。Pruneri等［7］研究发现，MDS患者的骨髓微血管密度（MVD）明显高于正常，但低于AML。在MDS中又以RAEBT、CMML及伴骨髓纤维化者更为显著，RA、RAEB、RAEBT组呈递增趋势，RAEBT组的MVD与AML组无明显差异。我们的实验结果显示RAEB、RAEBT患者的血清VEGF、bFGF水平均明显高于RA和RAS患者，这与Pruneri的研究结果相符，表明随着病情的发展，VEGF、bFGF的分泌逐渐增多，骨髓微血管密度逐渐增高，符合MDS的演变过程，提示VEGF、bFGF引起的血管新生可能在MDS的发展过程中起重要作用。我们的研究结果还显示RAEBT患者血清VEGF、bFGF水平均与AML患者无明显差异，间接反映其骨髓微血管增生程度与AML相似，提示VEGF、bFGF可能在MDS向白血病转化过程中起重要作用。新的WHO分类已经将RAEBT归为白血病，越来越多的证据表明这一改变是合理的。

    MDS的预后因素，国际IPSS评分包括外周血细胞受累、骨髓原始细胞比例及染色体分型等。我们的研究发现，MDS患者血清VEGF、bFGF水平与外周血细胞受累、骨髓原始细胞比例有关。外周血2-3系受累者明显高于1系受累者，骨髓原始细胞比例＞5％的各组血清VEGF、bFGF水平均明显高于＜5％组，因此血清VEGF、bFGF水平对于MDS的预后判断可能也有一定的意义。MDS患者血清VEGF、bFGF升高的原因尚不十分清楚。各种肿瘤细胞及正常细胞如血细胞、内皮细胞及间质浸润细胞等均可表达VEGF及bFGF。因此MDS患者的VEGF和bFGF可能由恶性细胞和正常细胞共同分泌。我们的研究发现，MDS患者的血清VEGF、bFGF浓度与骨髓原始细胞比例有关，原始细胞比例高的患者其血清VEGF、bFGF水平较高，提示VEGF、bFGF升高可能与肿瘤细胞的关系更为密切。

    目前，针对VEGF和bFGF的抗血管新生策略有抗VEGF、bFGF抗体、抗KDR抗体、可溶性VEGF受体、寡核苷酸、短肽抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂等。目前这些药物及治疗方法大部分尚不成熟，处于试验阶段。沙利度胺（thaldomide）是目前为止发现的最重要的抗血管新生的药物，对于MM的疗效已经得到肯定并广泛用于临床。最近的研究发现，沙利度胺对MDS也有一定的治疗作用［8,9］，Bertolini等［10］还发现，治疗有效者血清VEGF、bFGF水平明显下降，骨髓中活化的内皮细胞数量减少。研究MDS患者血管新生相关因子的表达对于指导临床治疗，寻求新的治疗方法具有重要的意义。

【】
  　　1Aguayo A, Kantarjian H, Manshouri T, et al. Angiogenesis in acute and chronic leukemias and myelodysplastic syndromes. Blood, 2000; 96: 2240-2245

2Aguayo A, Kantarjian HM, Estey EH, et al. Plasma vascular endothelial growth factor levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes. Cancer, 2002; 95: 1923-1930

3Alexandrakis MG, Passam FH, Pappa C, et al. Serum evaluation of angiogenic cytokine basic fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor and TNF?alpha in patients with myelodysplastic syndromes: correlation with bone marrow microvascular density. Int J Immunopathol Pharmacol, 2005;18:287-295

4Brunner B, Gunsilius E, Schumacher P, et al. Blood levels of angiogenin and vascular endothelial growth factor are elevated in myelodysplastic syndromes and in acute myeloid leukemia. J Hematother Stem Cell Res, 2002;11: 119-125

5Zorat F, Shetty V, Dutt D, et al. The clinical and biological effects of thalidomide in patients with myelodysplastic syndromes. Br J Haematol, 2001;115: 881-894

6Seghezzi G, Patel S, Ren C J, et al. Fibroblast growth factor?2 (FGF?2) induces vascular endothelial growth factor(VEGF) expression in the endothelial cells of forming capillaries: an autocrine mechanism contributing to angiogenesis. J Cell Biol, 1998;141: 1659-1673

7Pruneri G, Bertolini F, Soligo D, et al. Angiogenesis in myelodysplastic syndromes. Br J cancer,1999,81:1398-1401

8Strupp C, Germing U, Aivado M, et al. Thalidomide for the treatment of patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia, 2002,16:1-6

9Raza A, Meyer P, Dutt D, et al. Thalidomide produces transfusion independence in long standing refractory anemia of patients with myelodysplastic syndromes. Blood, 2001; 98:958-965

10Bertolini F, Mingrone W, Alietti A, et al. Thalidomide in multiple myeloma, myelodysplastic syndromes and histocytosis. Analysis of clinical results and of surrogate angiogenesis markers. Ann Oncol, 2001;12:987-990?